細胞生物學實驗細胞融合-wenkub
2023-02-02 02:30:56 本頁面
【正文】 的雜交瘤細胞的篩選 雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng) 單克隆抗體的生產(chǎn)和純化 生 產(chǎn) 過 程 單克隆抗體的大量制備過程 ? 一 細胞融合前準備 ? (一 )動物免疫與免疫脾細胞懸液的制備 ? 在腹腔免疫 1－ 2次后的 2－ 4周，于融合前 3— 4天加強免疫一次，這樣可以使抗原最近激活的 B淋巴細胞定位于脾臟，也使記憶細胞處在激活與分裂狀態(tài)。 ? 親本一：低溫敏感突變型，可在低溫下生長，在高溫下死亡。利用兩種親本細 胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。 融合時最適合的離子強度一般為。 ? ④ 細胞融合過程中 ， 通常耗氧量較大 ， 缺氧時經(jīng)常不融合 。 ? ③ 細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài) 。 優(yōu)點： ? 融合率高，達 70％－ 80％，甚至 100％ ? 可在顯微鏡下定向誘導細胞融合 ? 可直接挑選雜種細胞 ? 重復性強 、 對原生質(zhì)體傷害?。谎b置精巧 、方便簡單；免去 PEG誘導后的洗滌過程 、 誘導過程可控制性強等 。 原生質(zhì)體電融合過程 1）在高頻電流電場下的相互接觸。 1981年， Scheurich和 Zimmermann發(fā)明了電誘導細胞融合。 ? 融合過程中應(yīng)注意 ? ① 事先要做好兩種原生質(zhì)體的識別標記 ， 如色素 、缺陷型 、 抗性標記等 。 20世紀 70年代，華裔科學家高國南發(fā)現(xiàn)聚乙二醇能誘導細胞融合 ? 分子量小的 PEG， 融合效應(yīng)差 ， 又有毒性 ，分子量過大 ， 則粘性太大 ， 不易操作 。 細胞融合過程中兩個細胞膜的變化 形成細胞橋的具體變化 細胞融合分為兩種： （ 1）自發(fā)細胞融合 自發(fā)細胞融合（ spontaneous cell fusion）是在 未施加任何誘導條件 的情況下所發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象。 細胞核或細胞質(zhì)失活的有物理和化學方法： ，如 X射線、 r射線等，它們能使細胞核失活； ，核失活－碘乙酰胺（ IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（ R－ 6－ G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活作用。細胞融合實驗 概念 促融合劑與融合技術(shù) 應(yīng)用與意義 重點 一 定義： Cell fusion ?細胞融合 ： (Cell fusion)又稱 ?體細胞雜交 （ somatic hybridization） 是指將不同來源的原生質(zhì)體 (除去細胞壁的細胞 )相融合， 將兩個或多個細胞合并成 一個細胞的技術(shù)。 動物克隆 上海第二醫(yī)科大學 陳瑩博士 2022年，她將一 5歲男孩的包皮細胞與一只已去除細胞核 的新西蘭兔卵母細胞融合，獲得了人類早期胚胎。 自發(fā)細胞融合現(xiàn)象在自然界中并不多見，常見的主要有以下幾種情況： 1. 精子和卵子受精 2. 肌管的形成 3. 胚胎著床 4. 巨細胞的形成 5. 破骨細胞的形成 6. 腫瘤細胞融合 （ 2）誘導細胞融合 人工誘導細胞融合是在 人為條件下 發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象 常用的誘導方法有三種： 1. 生物法（病毒誘導法等） 2. 化學法（ PEG誘導法、 Ca 2+誘導法、 溶血卵磷脂誘導法等） 3. 物理法（電誘導法等） 常用的病毒：仙臺病毒（ Sendal virus), 又稱日本血凝病毒 ? （ Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） ? 屬于副粘液病毒科， RNA病毒，圓球形 ? 1962年，日本仙臺東北大學學者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘導細胞融合。 pH偏堿時融合效應(yīng)最高 。 ? ② 原生質(zhì)體的密度應(yīng)在 105個／ mL左右 ， 兩種原生質(zhì)體按 1： 1等量混合 。 電融合槽 在直流電脈沖的誘導 下，原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種原生質(zhì)體黏合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。 2）脈沖刺激后 30s 3)50秒后 4） 5） 6分鐘后 6） 15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。 融合指數(shù) （ fusion index） : 反映細胞融合的效率 有兩種計算方法： =（對照組細胞數(shù) 試驗組細胞數(shù)） /試驗組細胞數(shù) =多核細胞中的細胞核數(shù) /所有細胞中的細胞核數(shù) 不同細胞融合的條件及其主要應(yīng)用 ? 來源 前處理 融合的方法 主要應(yīng)用 ? 動物細胞 不需 仙臺病毒 , PEG ，電融合 生產(chǎn)單克隆抗體 ? 植物細胞 脫壁 PEG,電融合 創(chuàng)造植物新品種 ? 微生物細胞 脫壁 PEG, 高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種 同核體 同核體 異核體（雜交細胞） 未融合 未融合 加入融合劑 融合細胞的類型 ? 同核體： 由同一親本細胞融合而來 ? 異核體： （ heterokaryon） 有不同親本細胞融合而來 ? 異核體其細胞膜融合在一起，而融合的細胞含有兩個不同的細胞核。 如仙臺病毒誘導 腹水癌細胞融合時 ， 于 37℃ 振搖時易于融合 ， 且融合效率與病毒量呈正比 。 空氣中含氧量大于 20％ 時有一定融合率 ， 但有些細胞在無氧條件也可融合 。 ? ⑥ 最適合的 pH為 ， 在此范圍之外 ， 融合率均較低 。 ? 親本 A：色氨酸缺陷型 ? 親本 B：蘇氨酸缺陷型 ? 雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細胞均會死亡。 ? 親本二：高溫敏感突變型，可在高溫下生長，在低溫下死亡。許多資料結(jié)果表明，脾細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤的最佳時間，是在抗體形成高峰之前，而不是在抗體形成高峰期。 ? 淋巴細胞
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