【正文】 表面具有一定的物理吸附能力。 40 濃度溫度圖 41 二、過飽和溶液的形成 (結(jié)晶方法 ) （一）、蒸發(fā)法 （二）、 溫度誘導(dǎo)法 （三）、 鹽析結(jié)晶法 （四）、 透析結(jié)晶法 （五）、有機(jī)溶劑結(jié)晶法 42 溫度誘導(dǎo)法 43 鹽析結(jié)晶法 44 透析結(jié)晶法 45 （六）、 等電點(diǎn)法 （七）、微量擴(kuò)散法 （八）、 化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 調(diào)節(jié)溶液的 pH或向溶液中加入 反應(yīng)劑 ，生成新物質(zhì)，結(jié)晶析出。 38 一、結(jié)晶過程 指溶質(zhì)自動(dòng)從 過飽和溶液 中析出形成新相的過程 。 29 二、成鹽沉淀法 1．金屬離子沉淀： Mn2+、 Fe2+、 Co2+、 Ni2+、 Zn2+、 Ca2+、Ba2+、 Mg2+等； 2．生成有機(jī)酸類復(fù)合鹽沉淀 （ 1）丹寧即鞣酸 （ 2） 雷凡諾 （ 3） 三氯乙酸 （ TCA） 30 雷凡諾 ? 31 豬心提取液 洗脫液 上清液 上清 細(xì)胞色素 C 沉淀（去除） 32 吸附 人造沸石 鹽析 45%飽和硫酸銨 沉淀 TCA 透析 豬心中提取細(xì)胞色素 C的工藝 三、親和沉淀 利用親和反應(yīng)原理，將配基與可溶性的載體偶聯(lián)后形成 載體 配基復(fù)合物（親和沉淀劑） ，該復(fù)合物可選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合，在一定條件下沉淀出來。 濃度大時(shí)，增加共沉作用，降低分辨率。 （四）無機(jī)鹽的含量 低鹽：有利于沉淀，還有保護(hù)蛋白質(zhì)，防止變性。 ? 缺點(diǎn)： 容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需 防火防爆 。 16 分部鹽析法 17 反抽提法 (RNA聚合酶 ) 18 注意事項(xiàng) ? “局部過濃 ” ?溫度 （室溫） ?分離方法 19 第二節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀 (Organic Solvent Precipitation) ? 定義：向水溶液中加入一定量 親水性 的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的 溶解度 ，使其沉淀析出的分離純化方法。 PO4 3＞ SO42― ＞ CH3COO― ＞ Cl― ＞ NO3― ＞ I― NH4+＞ K+＞ Na+＞ Li+ 鹽析用鹽常用硫酸銨 9 二、影響鹽析的因素 (二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響 血纖維蛋白原碳氧血紅蛋白血清白蛋白擬球蛋白碳氧肌紅蛋白μ0 . 5 000 . 5 01 . 0 00 2 4 6 8 1 0log S10 鹽析分布曲線 11 （三）蛋白質(zhì)濃度的影響 12 d dS P1098765432104 0 5 0 6 0 7 0 8 0P3 0 g / L 3 g / L蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少。 ? KS是鹽析常數(shù) ，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)，但與溫度和 pH無關(guān)。 ? 中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了 水化膜 ，使其沉淀。第五章 固相析出分離法 ? 通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)。 6 在鹽析區(qū)，符合公式 logS=?Ks? S——蛋白質(zhì)溶解度 ， g/L； ?—鹽離子強(qiáng)度 , Ci——i離子濃度 ， mol/L； Zi——i離子化合價(jià)； ?——常數(shù) ,為縱坐標(biāo)上的截距 。 ? 兩種類型： （ 1）在一定的 pH和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析，稱作 Ks鹽析法 。 碳氧肌紅蛋白 （四）溫度的影響 13 210log S2 3 4 μ25 ℃0℃p H 6 . 6溫度的變化會(huì)影響 ?值 在無鹽或稀鹽溶液中 ， 大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度 是隨溫度升高而增大的 ， 但在 高鹽溶液中常相反 （五） pH的影響 ? 當(dāng)溶液的 pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近時(shí)， ?值最小。 20 降低了介質(zhì)的 介電常數(shù) ，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。 23 二、影響沉淀效果的因素 （一）有機(jī)溶劑種類及用量 常用的溶劑有乙醇、丙酮、甲醇等。 高鹽 ：增大蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑 ― 水溶液中的溶解度，沉淀物中可能夾帶鹽。 蛋白質(zhì)濃度 %～ 2%； 粘多糖濃度 1%～ 2%。 33 34 胰蛋白酶提取工藝 四、 高分子聚合物沉淀 水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（ PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使 蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀 。 C2 — 小晶體的溶解度 ； C1 — 普通晶體的溶解度； ρ — 晶體密度； M — 晶體質(zhì)量； σ — 晶體與溶液間的界面張力； γ 2 — 小晶體的半徑 ； γ 1 — 普通晶體的半徑； 39 )11(2ln1212rrRTMCC ????結(jié)晶包括三個(gè)過程： (1) 形成 過飽和溶液 。 （九）、共沸蒸餾結(jié)晶 46 等電點(diǎn)法 47 化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 48 綜合利用 49 三、提高晶體質(zhì)量的途徑 工業(yè)上通常希望得到 粗大而均勻 的晶體，便于過濾與洗滌。 重結(jié)晶： 即將晶體用合適的溶劑溶解再次結(jié)晶 。 第六章 吸附分離法 54 55 ? 吸附法 (adsorption method)指利用吸附作用，將樣品中的 生物活性物質(zhì) 或 雜質(zhì) 吸附于適當(dāng)?shù)奈絼┥?，利用吸附劑?duì)活性物質(zhì)和雜質(zhì)間 吸附能力 的差異，使目的物和其它物質(zhì)分離，達(dá)到濃縮和提純目的的方法。 (2)一些無機(jī)吸附劑性能不穩(wěn)定。 吸附劑用量 。 75 六、氧化鋁 (Aluminum oxide) 適用于親脂成分的分離 堿性氧化鋁： 中性氧化鋁： 酸性氧化鋁： 76 氧化鋁吸附層析純化維生素 B12 影響因素： (1) Al2O3的顆粒度要均勻 ， 流速控制要很慢； (2) 溫度宜在 20℃ 以下層析 ， 洗脫在室溫中進(jìn)行； (3)利用 B12在丙酮中不溶的特性 ， 在冰凍條件下結(jié)晶 3天 ， 結(jié)晶析出 。 ? 常用洗脫劑排序（極性增大）： 石油醚 甲苯 乙醚 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇 水 乙酸 80 氧化鋁或硅膠為吸附劑 ? 洗脫劑從極性低的開始 逐漸增加極性 。 82 第三節(jié) 大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑 大網(wǎng)格吸附劑 (macroreticular adsorbent ) （大孔網(wǎng)狀樹脂， macroreticular resin ） 在樹脂聚合時(shí)加入惰性的 致孔劑 ，待網(wǎng)格骨架固化和鏈結(jié)構(gòu)單元形成后，用溶劑萃取或蒸餾水洗將致孔劑去掉，形成不受外界環(huán)境條件影響的孔隙，其孔徑遠(yuǎn)大于 2～ 4nm，可達(dá)100nm，故稱 “ 大孔 ” 。 84 一、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑的類型和結(jié)構(gòu) 可分為 非極性、中等極性、極性和強(qiáng)極性吸附劑 四類。 ? 而中等極性的吸附劑則對(duì)上述兩種情況都具有吸附能力。選用溶劑應(yīng)容易 溶解吸附物 。 98 第一節(jié) 凝膠層析的基本原理 ? 凝膠層析的分離過程是在裝有多孔物質(zhì)填料的柱中進(jìn)行的 。 ? 平衡條件只是在流速很慢時(shí)的一個(gè)極端情況 。 ? 樣品加入，以水或其他溶液進(jìn)行洗脫，即得洗脫曲線 。 流經(jīng)體積是外水體積與內(nèi)水體積之和 V0+Vi。 ? 當(dāng) Kd=0時(shí) ， 洗脫體積 Ve=V0， 為全排阻 。 ? （ 3） 分離條件緩和 。 ? 再經(jīng) 3氯 1， 2環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑 ，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。 ? 吸附作用 。 ? 常用 %疊氮化鈉 、