酶分子修飾ppt課件(2)-wenkub
2023-01-20 20:11:27 本頁面
【正文】 使酶的催化特性得以改進的技術(shù)過程。 ? 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴大酶的應用范圍。 ? 產(chǎn)生新的催化能力。 2）主鏈切斷后仍可維持酶活性中心的空間構(gòu)象，酶的催化能力保持不變或損失不多，其抗原性等特性發(fā)生改變。 ? 核苷酸置換修飾 ：將核酸類酶核苷酸鏈上的某一個核苷酸換成另一個核苷酸的修飾方法。 采用核苷酸置換修飾技術(shù)將保守核苷酸以外的某個或某些核苷酸置換，就可以獲得各種不同的人造核酸類酶。是蛋白質(zhì)工程（ protein engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。 6. 酶分子的物理修飾 ? 通過物理修飾，可以了解 不同物理條件 下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子 空間構(gòu)象 的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。 屬于蛋白質(zhì)的 非合理設(shè)計 ，它 不需事先了解 酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制。 ? 定向進化 =隨機突變 +定向選擇 。 易錯 PCR技術(shù) ? 特點：操作簡便，隨機突變豐富。 DNA重排技術(shù)為代表的有性進化 DNA重排技術(shù)： 又稱 DNA改組技術(shù)，有性 PCR（ sexual PCR）。 基因家族之間的同源重組 從自然界中存在的基因家族出發(fā)，利用它們之間的同源順序進行 DNA改組實現(xiàn)同源重組。 酶分子定向進化的選擇策略 ?定向進化中，突變具有隨機性，但通過 選擇特定方向的突變限定了進化趨勢 ，加之控制實驗條件，限定突變種類， 降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。 ? 質(zhì)量要求：文庫 包容性 和文庫 完整性 ? 過程： ? 載體選擇 ? 基因重組 ? 形成基因文庫 ? 質(zhì)粒 ? 噬菌體 DNA ? 黏粒載體 ? 噬菌粒載體 ? 轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)導 突變基因的篩選 （ 1）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定 （ 2）高通量篩選技術(shù) ? 平板篩選技術(shù) ? 熒光篩選法 ? 噬菌體表面展示法 ? 酵母細胞表面展示法 舉例 ? 例 1：定向進化提高枯草芽孢桿菌脂肪酶的活力 ? 例 2：大腸桿菌堿性磷酸酶的體外定向進化研究 ? 例 3：采用易錯 PCR對粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶 C進行定向進化 酶 性 質(zhì) 突變方法 枯草桿菌蛋白酶 E 有機相活性 /穩(wěn)定性 易錯 PCR β內(nèi)酰胺酶 總活力 /底物專一性 DNA改組 枯草桿菌蛋白酶 BPN′ 穩(wěn)定性 盒式誘變 對硝基苯酯酶 底
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