信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法(1)-wenkub
2023-05-23 05:14:32 本頁(yè)面
【正文】 PCR In situ hybridization Northern blots RNase protection assay Primer extention assay 比較轉(zhuǎn)錄組學(xué) : Differential screening Subtractive hybridization Differential display Arraybased methods 1. 蛋白質(zhì)表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位研究 ? 信號(hào)蛋白分子表達(dá)水平檢測(cè) : ? Western blot analysis. ? ELISA ? Proteomics ? 信號(hào)蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)定位研究 : ? Immunohistochemistry / Immunocytochemistry ? Immunofluorescence (IF) ? Green fluorescent protein (GFP)fusion protein—typically, live cells. 印跡技術(shù) blotting ? 將在凝膠中分離的生物大分子轉(zhuǎn)移到固相化介質(zhì)上，并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。 Western blotting Electrophoresis 轉(zhuǎn)膜 Protein HRP DAB H2O2 1Ab 2Ab 抽提細(xì)胞蛋白，定量 聚丙烯酰胺凝膠電泳 與特異性抗體雜交。 2. 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) : ? CoIP（ 免疫共沉淀 ） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein ? GST pulldown assay ? Yeast twohybrid assay ? FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay agarose bead ? IP 是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“ protein A/G‖能特異結(jié)合免疫球蛋白 FC片段的現(xiàn)象而發(fā)展的方法。進(jìn)一步進(jìn)行 Western Blot和質(zhì)譜分析。一般在發(fā)現(xiàn)抗體干擾蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，可以啟用 GST沉降技術(shù)。 ? 以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。 但限于核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用 。 以內(nèi)的受體熒光基團(tuán) (EGFP–Y)，使之發(fā)出熒光。均有商品化的試劑盒。 每產(chǎn)生一條 DNA鏈，就切斷一條探針，每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)， 信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的 DNA分子數(shù)成正比 。 甲醛處理使蛋白質(zhì)與染色質(zhì) DNA交聯(lián)； 超聲波或酶處理使染色質(zhì) DNA片段化； 抗體沉淀蛋白質(zhì) DNA交聯(lián)復(fù) 合體 （ IP） ； 消化蛋白 ， 解除交聯(lián) ， 純化 DNA； 檢測(cè)分析 (PCR, qPCR, Microarray) 6. 基因或蛋白質(zhì)功能研究 ? 改變基因結(jié)構(gòu) ? 基因突變（點(diǎn)突變、缺失、融合等） ? 將突變基因或蛋白引入細(xì)胞以檢測(cè)其功能 Dominant negative mutants (缺失結(jié)構(gòu)域突變體 ) (1) Ligandbinding site (2) Phosphorylation site (3) Docking site (4) Proteinprotein binding site (5) DNA binding site ? 基因表達(dá)或蛋白質(zhì)活性的抑制， 觀察表型變化推測(cè)基因功能 ? RNAi— use of small interfering RNA (siRNA) to reduce specific mRNA levels. ? Antisense oligonucleotides ? Ribozyme ? Monoclonal Antibody ? Small inhibitor molecules： tyrosine kinase inhibi
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