目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建-wenkub
2023-05-21 21:34:00 本頁面
【正文】 Klenow酶聚合 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 大片段酶促法： 混合退火 根據(jù)目的基因 的 全序列，分別合成 4050堿基長的單鏈 DNA片段 T4DNA連接酶連接 克隆入合適的載體 Klenow酶聚合 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成 DNA的 單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產(chǎn)物收率為 95%則合成 50個堿基長的 DNA單鏈大片段的總收率只有 % 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其 編碼的 DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或 cDNA法得到 的重組子，最終獲得含有目的基因的 目的重組子 由于大多數(shù)氨基酸擁有 簡并密碼子 ，故在探針序列的設(shè)計時 必須考慮下列問題： 生物體對簡并密碼子的 偏愛性 ， 合成系列探針 探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在 1720個核苷酸之間 探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 某段連續(xù)的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的 DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 設(shè)計的簡并探針序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外還可以參考各種生物體的 EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行傾向性簡并序列設(shè)計 expressed sequence tag 化學(xué)合成的單元操作 化學(xué)合成 DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去 ， 每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng) ， 包括： 基團(tuán)保護(hù) 、分離 、 縮合 、 分離 、 去保護(hù) 五大操作單元 。很顯然， cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫 基因文庫的基本概念 基因文庫的完備性 基因文庫的 完備性 是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概 率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù) N之間的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕? f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 例如，人的單倍體 DNA總長為 x 109 bp， 基因文庫中克隆片段 的平均大小為 15 kb， 則構(gòu)建一個完備性為 基因文庫至少需要 45萬個克隆；而當(dāng)完備性提高到 ，基因文庫至少需要 180 萬個克隆 基因文庫的基本概念 基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 除了盡可能高的 完備性外， 一個理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件： 重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力 載體的裝載量最好大于基因的長度 避免基因被分隔克隆 克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域 以利克隆排序 克隆片段易于從載體分子上完整卸下 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選 基因文庫的構(gòu)建程序 基因組 DNA的制備 為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性， 用于基因組 文庫構(gòu)建的 DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。這項工作的工作量可能遠(yuǎn)大于基因組文庫的構(gòu)建，屬于基因文庫的后期制作 基因組文庫重組克隆的排序 將單一的 YAC克隆插入 DNA片段 用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素 然后再用 Sau3AI或 MboI將末端標(biāo)記的 DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每 10個 YAC克隆走在同一塊板上，形成 10個克隆的特征性 DNA指紋圖譜 電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個克隆 DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個 YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個 YAC克隆的 DNA片段克隆在染色體上是排列一起的 酶切片段末端標(biāo)記法 酶切片段末端標(biāo)記法 H H H H S S S
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