目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為 轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá) 的受體細(xì)胞 篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立） 鳥(niǎo)槍法操作的改進(jìn) 使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。 從反應(yīng)機(jī)理上來(lái)講， DNA化學(xué)合成有 磷酸二酯法 、 磷酸三酯法 、 亞磷酸液三酯法 ；具體操作過(guò)程又有 液相合成 和 固相合成 兩種形式。制備的 DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的 DNA片段 的比率就越低，重組率和完備性也就越高 A A A A 用常規(guī)方法制備的染色體 DNA的長(zhǎng)度一般在 100 kb左右 如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝 膠中，然后置入含有 SDS、 蛋 白酶 K、 RNase的緩沖液中浸泡，可獲得 1000 kb大小的 DNA片段 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 基因組 DNA的切割 用于基因組 文庫(kù)構(gòu)建的 DNA片段的切割一般采用 超聲波處理 和 限制性?xún)?nèi)切酶 部分酶切 兩種方法，其目的是： 第一，保證 DNA片段之間存在部分重疊區(qū) 第二，保證 DNA片段大小均一 超聲波處理 后的 DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭 部分酶切法 一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性?xún)?nèi)切酶 ， 如： Sau3AI或 MboI等，這樣 DNA酶解片段的大小可控 連接前，上述處理的 DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí) 分離，以杜絕不相干的 DNA片段隨機(jī)連為一體！ 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 載體和受體的選擇 出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于 基因組 文庫(kù) 構(gòu)建的 載體通常選 裝載量較大的 lDNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和 人類(lèi)）需使用 YAC或 BAC載體 lDNA 由于絕大多數(shù)真核生物的 mRNA小于 10 kb， 因此用于 cDNA文庫(kù) 構(gòu) 建的載體 通常選質(zhì)粒 上述幾種 載體的最大裝載量如下： 質(zhì)粒 考斯質(zhì)粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 用于基因 文庫(kù)構(gòu) 建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌 基因文庫(kù)的構(gòu)建程序 從基因文庫(kù)中篩選目的基因 大型基因組 文庫(kù) 一般由數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)重組克隆組成。若將雜交陽(yáng)性結(jié)果記為 ? 1?，而陰性結(jié)果記為 ? 0? ，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序 隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 基因組文庫(kù)重組克隆的排序 從基因文庫(kù)中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆 ， 亞克隆片段在 kb范圍內(nèi) 分別以上述亞克隆 DNA片段為探針，雜交同一基因文庫(kù)，雜交陽(yáng)性克隆中的插入 DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的 DNA片段連鎖在一起 然后再以陽(yáng)性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體 DNA的端點(diǎn) 染色體走讀法（ chromosome walking） 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段 亞克隆旁測(cè)序列 探針標(biāo)記 第一輪雜交 陽(yáng)性克隆 陽(yáng)性克隆 第二輪雜交 第二輪雜交 染色體走讀法（ chromosome walking） 走讀的起點(diǎn)克隆片段
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