sds聚丙烯酰胺凝膠電泳-wenkub
2023-05-21 13:13:54 本頁(yè)面
【正文】 判別函數(shù)，如此重復(fù) 1,000次，這樣我們得到了 1,000個(gè)判別函數(shù)，如第一個(gè)判別函數(shù)為： HEG1=－ ＋ － ＋ － － ＋ (1) LEG1=－ ＋ － － ＋ ＋ － (2) ? 這里的 X1, X2, X3, X4, X5 和 X6分別代表區(qū)間 [18,123]， [31,140]， [35,150]， [90,118]，[90,151]和 [95,135]的用 RNAfold軟件計(jì)算的最低自由能（計(jì)算溫度參數(shù)設(shè)為 30℃ ）。 ? 確認(rèn)表達(dá)載體的翻譯終止密碼子前后各 100bp的序列，據(jù)此對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)構(gòu)建 200bp的片段。 AOX1區(qū)與基因組的AOX1基因的末端發(fā)生整合重組 表達(dá)載體與畢赤酵母基因組發(fā)生重組的兩種方式： 2. 載體的 HIS4區(qū)與基因組的 HIS4基因的末端發(fā)生整合重組 甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素 ? 載體穩(wěn)定性：是整合還是粘附到酵母染色體上 ? 基因劑量：?jiǎn)?/多拷貝 ? 甲醇利用表型： Muts(利用甲醇慢型 )， Mut+ (利用甲醇快型 ) ? mRNA5′端：應(yīng)盡量避免在 UTR區(qū)出現(xiàn) AUG和次級(jí)結(jié)構(gòu) ? AT含量： AT含量越高、越容易出現(xiàn)類(lèi)似于終止子的結(jié)構(gòu) ? 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性：分泌表達(dá)時(shí)，胞外蛋白酶是要影響因素 外源基因的 339。 第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的預(yù)測(cè) 微觀的酵母細(xì)胞 ? 539。 ? 酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有生長(zhǎng)快、易于遺傳操作、能對(duì)外源蛋白進(jìn)行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點(diǎn)，被認(rèn)為是表達(dá)外源蛋白的合適宿主。 ? 幾種工業(yè)酵母尤其是巴氏畢赤酵母 (pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生長(zhǎng)力以及其它一些獨(dú)特的性質(zhì)，已發(fā)展成為較成熟的蛋白生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。AOX1 啟動(dòng)子片段含有 AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)； ? α因子信號(hào)肽序列為約 89個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化； ? 多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)； ? TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和 polyA修飾信號(hào)； ? HIS4為營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志； ? 339。末端的最低自由能穩(wěn)定性對(duì)于實(shí)現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中成功高效表達(dá)是比較重要的因素，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組聯(lián)合北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授課題組建立了一個(gè)針對(duì) pPIC9表達(dá)載體在畢赤酵母中高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型。 ? 從上述每個(gè)基因的 200bp片段，截取 9,000個(gè)區(qū)間，截取方式為 [X, Y], X和 Y在 200bp片段的范圍為 1≤X≤100, 和 111≤Y≤200。 ? 對(duì)于每個(gè)新數(shù)據(jù)，為了預(yù)測(cè)該基因是否能在酵母中高效表達(dá)（表達(dá)水平大于 100 mg/L），可先計(jì)算這 6個(gè)區(qū)間的最低自由能，然后運(yùn)算上述的 1,000個(gè)判別函數(shù)，來(lái)評(píng)估該基因高效表達(dá)的概率。 ? 其數(shù)值運(yùn)算于 1,000個(gè)判別函數(shù)，結(jié)果表明 NGAL在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率為 ，雖然 ，但我們?nèi)韵胪ㄟ^(guò)表達(dá)這個(gè)基因來(lái)驗(yàn)證酵母高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型。 單體丙烯酰胺和 N,N甲叉雙丙烯酰胺的聚合 催化劑 Acr Bis ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強(qiáng)還原劑的 SDS溶液中與 SDS分子結(jié)合時(shí)，可形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物。 ? 因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)（亞基）分子大小。 分子量 相對(duì)遷移率 被分離物質(zhì)分子量與凝膠濃度的選擇 分子量范圍 適用的凝膠濃度 (%) 蛋 白 質(zhì) ?104 2030 14 104 1520 15 1041 105 1015 1 105 510 ?5 105 25 核 酸 (DNA/RNA) ?104 1520 104–105 510 1052 106 按照緩
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