【正文】 因組中差異甲基化功能基因啟動子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。通過這些研究，使我國在魚類功能基因組研究中居國際領(lǐng)先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 采用大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 項(xiàng)目名稱： 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 首席科學(xué)家： 桂建芳 中國科學(xué)院水生生物研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國科學(xué)院 湖北省科技廳 一、研究內(nèi)容 基于擬解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這 兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題， 本項(xiàng)目擬集中在魚類主要經(jīng)濟(jì)性狀如生殖、生長、抗性 的功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)方面， 重點(diǎn)解析這些主要經(jīng)濟(jì)性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開拓關(guān)鍵技術(shù)，其主要研究內(nèi)容包括： 1） 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 及其分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用基因轉(zhuǎn)移、 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降等技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤和免疫熒光定位等方法，重點(diǎn)解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示重要生殖調(diào)控基因在魚類卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換中的功能作用及其調(diào)控機(jī)制；探討魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及其及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；通過大規(guī)模 RFLP 分析等呈現(xiàn)技術(shù)，篩選雌雄個(gè)體間性別特異的 DNA 片段標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic Walking 克隆分離與性別決定和性別分化相關(guān)基因；揭示魚類性別決定和性別 分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 4）魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們在群體和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 解析魚類生殖、 生長、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 篩選鑒定 具有自主知識產(chǎn)權(quán)、 可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的功能基因和分子標(biāo)記 30－ 50 個(gè) ； 3. 揭示魚類性別決定與分化、卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制； 4. 闡明魚類生長激素分泌的信號通路； 5. 闡明魚類 干擾素系統(tǒng)關(guān)鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機(jī)理；闡明魚類抗寒關(guān)鍵信號通路及其作用機(jī)理； 6. 建立魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設(shè)計(jì)和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長 或抗性等目 標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國際影響的中青年學(xué)術(shù)帶頭人 和學(xué)術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文，其中在有重要國際影響的期刊（ 相關(guān)領(lǐng)域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，輔以其它分子生物學(xué)方法如目的基因表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導(dǎo)處理等來分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。 3) 新 穎 的學(xué)術(shù)思路， 起到前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用 ： 本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)了國際上有關(guān)魚類分子設(shè)計(jì)育種的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題，試圖直接通過解析魚類生殖、生長和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來闡明其調(diào)控機(jī)理，篩選鑒定可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，由此創(chuàng)建魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，對 指導(dǎo)并推動我國水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展具有重要的前瞻性、戰(zhàn)略性和引領(lǐng)性作用。 3) 堅(jiān)實(shí)、完善的研究基地，支撐有力： 本項(xiàng)目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、有害生物控制和資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)部門重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室研究基地的研究條件，這些實(shí)驗(yàn)室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí)支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 以下將具體說明各課題的主要研究目標(biāo)、主要研究內(nèi)容、承擔(dān)單位、課題負(fù)責(zé) 人及主要學(xué)術(shù)骨干和經(jīng)費(fèi)比例等。 主要研究內(nèi)容： 魚類下丘腦 /垂體的功能基因組以及魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理研究； 腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路和對魚類生長調(diào)控機(jī)制研究； 抑肌素信號調(diào)控在魚類肌肉細(xì)胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用機(jī)理研究； 可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系研制及其生理學(xué)功能分析； 魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律研究； 生長調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑研究。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所、中國科學(xué)院海洋研究所 課題負(fù)責(zé)人 ： 陳良標(biāo) 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 沈玉、曹立雪、譚訓(xùn)剛、尤鋒 經(jīng)費(fèi)比例： 10% 課題 5 魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)研究 主要研究目標(biāo)： 建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)；揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系；闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀 主效基因轉(zhuǎn)錄組以及在群體和家系中的功能；確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評估其育種效率；創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合育種的技術(shù)路線。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計(jì)劃 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫構(gòu)建以及與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號表達(dá)水平改 變對魚體肌肉生長的調(diào)控研究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚 QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗(yàn)證； 7. 魚類生長和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長激素受體基因的分子設(shè)計(jì) ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測序。 7. MAPPING 到圖譜上 300個(gè)標(biāo)記以上；建立后備親魚的核心群體 100尾以上；圖譜定位 QTL1020個(gè)，獲得基因同線性分析的結(jié)果； 8. 獲得可用于魚類轉(zhuǎn)基因的高效的轉(zhuǎn)座子 和 Cre/lox基因靶位操作體系 ， 獲得 EAF1等基因敲除的斑馬魚胚胎； 9. 獲得轉(zhuǎn)基因魚 P0代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)基因敲落 的胚胎和 原生殖細(xì)胞特異啟動子系統(tǒng) ， 揭示小RNA動態(tài)變化規(guī)律，獲得相關(guān)互作蛋白。 子代親本 2020 尾以上；分析鯉魚 QTL或主效基因的聚合效應(yīng)、育種效率與潛力； 8. 獲得可用于原生殖細(xì)胞操作的、的基因操作載體 ， 獲得具有表型效應(yīng)的基因敲除的純合子個(gè)體；