【正文】 第五章 微生物的生長(zhǎng)(shēngzhǎng)及其控制,第一節(jié) 微生物生長(zhǎng) 1 微生物生長(zhǎng)的概念 2 微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定(c232。d236。ng) 3 微生物群體生長(zhǎng)的規(guī)律 第二節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的因素 1 物理因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 2 化學(xué)因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 第三節(jié) 微生物生長(zhǎng)的控制,第一頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第一節(jié) 微生物生長(zhǎng) 1 微生物生長(zhǎng)的概念 微生物在適宜的外界環(huán)境條件下，不斷地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并按自身的代謝方式進(jìn)行新陳代謝，如同化作用大于異化作用，其結(jié)果是原生質(zhì)的總量〔包括重量、體積、大小〕不斷地增加，稱(chēng)為微生物的生長(zhǎng)現(xiàn)象。生長(zhǎng)定義為微生物細(xì)胞在群體水平上增加，也可以認(rèn)為是微生物群體數(shù)量增加。許多微生物是以二分裂的方式生長(zhǎng)的。一般細(xì)胞分裂和染色體復(fù)制是協(xié)調(diào)控制的。 單細(xì)胞微生物如細(xì)菌的生長(zhǎng)，往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加。當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，就以二分裂方式，形成兩個(gè)相似的子細(xì)胞，子細(xì)胞又重復(fù)上述過(guò)程，使細(xì)胞數(shù)目增加，稱(chēng)為繁殖。在多細(xì)胞微生物中，例如某些霉菌，細(xì)胞數(shù)目的增加如不伴隨著個(gè)體數(shù)目的增加，只能叫生長(zhǎng)，不能叫繁殖。例如菌絲細(xì)胞的不斷延長(zhǎng)(y225。nch225。ng)或分裂產(chǎn)生同類(lèi)細(xì)胞均屬生長(zhǎng)，只有通過(guò)形成無(wú)性孢子或有性孢子使得個(gè)體數(shù)目增加的過(guò)程才叫做繁殖。,第二頁(yè)，共九十四頁(yè)。,在一般情況下，當(dāng)環(huán)境條件適合，生長(zhǎng)與繁殖始終是交替進(jìn)行的。從生長(zhǎng)到繁殖是一個(gè)由量變到質(zhì)變的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程就是發(fā)育。 生長(zhǎng)是細(xì)胞逐步發(fā)生的量變過(guò)程， 繁殖是產(chǎn)生新的細(xì)胞個(gè)體的質(zhì)變過(guò)程，伴隨(b224。n su237。)著細(xì)胞總數(shù)的增加。 個(gè)體生長(zhǎng) → 個(gè)體繁殖 → 群體生長(zhǎng) 群體生長(zhǎng)=個(gè)體生長(zhǎng)+個(gè)體繁殖 微生物特別是單細(xì)胞微生物，體積很小，個(gè)體生長(zhǎng)很難測(cè)定，意義也不大。通常測(cè)定微生物的生長(zhǎng)是測(cè)群體的生長(zhǎng)，而測(cè)定繁殖那么都要建立在計(jì)數(shù)這一根底上。 測(cè)生長(zhǎng)量的方法如下： 測(cè)定生長(zhǎng)量的方法有許多種，適用于一切微生物。,第三頁(yè)，共九十四頁(yè)。,2 生長(zhǎng)量的測(cè)定： 一、直接法 1．測(cè)體積 它是一種較為粗放的方法，例如將待測(cè)培養(yǎng)液放在刻度離心管中作自然沉降或進(jìn)行(j236。nx237。ng)一定時(shí)間的離心，然后觀察沉降物的體積。 2．稱(chēng)干重 采用離心法或過(guò)濾法測(cè)定，一般干重為濕重的10~20%。如用離心法，將待測(cè)培養(yǎng)液離心，再用清水洗滌離心1~5次后枯燥，可用105℃、100℃或紅外線烘干，也可在較低的溫度〔80℃或40℃〕下進(jìn)行真空枯燥，然后稱(chēng)干重。如細(xì)菌一個(gè)細(xì)胞一般重1012~1013g。如為絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾后，細(xì)胞可用少量水洗滌，再真空枯燥〔40℃以下〕，稱(chēng)干重。以乳酸菌為例，在液體培養(yǎng)基中，細(xì)胞的濃度大約為2108個(gè)/ ml。100 ml培養(yǎng)物可得10~70mg干重的細(xì)胞。 二、間接法 生理指標(biāo)法 與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們均可用作生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。 〔1〕 測(cè)定細(xì)胞總含氮量來(lái)確定細(xì)菌濃度 大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%?？偟颗c細(xì)胞粗蛋白的含量〔因其中包括了雜環(huán)氮和氧化型氮〕的關(guān)系可用下式計(jì)算： 粗蛋白總量=含氮量%,第四頁(yè)，共九十四頁(yè)。,含氮量的測(cè)定方法有很多，常用凱氏定氮法。此法適用于細(xì)胞濃度較高的樣品，同時(shí)操作過(guò)程也較麻煩，主要用于科學(xué)研究中。 〔2〕含碳量的測(cè)定 微生物新陳代謝的結(jié)果，必然要消耗或產(chǎn)生一定量的物質(zhì)，以表示微生物的生長(zhǎng)量。一般生長(zhǎng)旺盛時(shí)消耗的物質(zhì)就多，或者(hu242。zhě)積累的某種代謝產(chǎn)物也多。將少量生物材料混入1ml水或無(wú)機(jī)緩沖液中，用2ml2%重鉻酸鉀溶液在100℃下加熱30分鐘，冷卻后，加水稀釋至5ml，在580nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值〔用試劑作空白對(duì)照，并用標(biāo)準(zhǔn)樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線〕，即可推算出生長(zhǎng)量。 〔3〕其它 磷、DNA、RNA、ATP和 N–乙酰胞壁酸等的含量，以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn)CO2〔用標(biāo)記葡萄糖作基質(zhì)〕、耗氧、粘度和產(chǎn)熱等指標(biāo)，均可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。 比濁法 微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由于原生質(zhì)含量的增加，引起培養(yǎng)物混濁度的增高。最古老的比濁法是采用McFarland比濁管，用不同濃度的Bacl2與稀H2SO4配制成的10支試管，其中形成的BaSO4有10個(gè)梯度，表示10個(gè)相對(duì)的細(xì)菌濃度〔預(yù)先用相應(yīng)的細(xì)菌測(cè)定〕。某一未知濃度的菌液在透射光下用肉眼與某一比濁管進(jìn)行比較，如果兩者的濁度相當(dāng)，即可目測(cè)出該菌液的大致濃度。 精確的測(cè)定，要用分光光度計(jì)進(jìn)行。在可見(jiàn)光的450~650nm波長(zhǎng)內(nèi)均可測(cè)定。,第五頁(yè)，共九十四頁(yè)。,三、計(jì)數(shù)法 計(jì)數(shù)法即是計(jì)算微生物繁殖出的個(gè)體數(shù)目，此法適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子。 〔一〕直接法 直接法即是在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，其計(jì)數(shù)結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。 比例計(jì)數(shù)法 是一種粗放的計(jì)數(shù)方法。將顆?！怖缑咕逆咦踊蚣t細(xì)胞等〕濃度的液體與待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，然后鏡檢各自的數(shù)目，求出未知菌液中的細(xì)胞濃度。 血球計(jì)數(shù)板法 計(jì)數(shù)一定容積中的細(xì)胞總數(shù)的常用方法，此法對(duì)細(xì)胞較大的酵母菌較為適用。詳細(xì)方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)。 〔二〕間接法 是一種活菌計(jì)數(shù)法，其原理是活菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖使液體混濁，在固體培養(yǎng)基外表形成菌落，然后計(jì)數(shù)活菌的方法。 平板菌落計(jì)數(shù)法 是一種常用的食品中細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)法，有標(biāo)準(zhǔn)方法將待測(cè)樣品稀釋?zhuān)缓笕∵m宜的稀釋度樣品與固體培養(yǎng)基混勻，凝固后培養(yǎng)，然后計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以樣品的稀釋度，即可計(jì)算出樣品的含菌數(shù)。也可用涂布法將稀釋樣品接種在凝固的平板培養(yǎng)基上，后續(xù)方法同前。此法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)的結(jié)果較為精確(jīngqu232。)，缺點(diǎn)是方法煩瑣，獲得檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間長(zhǎng)。,第六頁(yè)，共九十四頁(yè)。,血球計(jì)數(shù)(j236。 sh249。)板方法,第七頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第八頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第九頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第十頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第十一頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第十二頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第十三頁(yè)，共九十四頁(yè)。,計(jì)數(shù)(j236。 sh249。)的方法,GB方法(fāngfǎ) 培養(yǎng)的溫度、時(shí)間嚴(yán)格 生長(zhǎng)的特殊性,要求計(jì)數(shù)范圍在30—300之間的菌落，當(dāng)大于300或小于30時(shí)，那么以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘上稀釋倍數(shù) 呈片狀生長(zhǎng)的菌落超過(guò)培養(yǎng)皿的一半(yīb224。n)不能計(jì)數(shù) 當(dāng)其兩個(gè)稀釋度都在30300間，二者的比值大于2時(shí)，以其中小的數(shù)報(bào)告 當(dāng)其兩個(gè)稀釋度的比值小于或等于2時(shí)，以應(yīng)報(bào)告其平均數(shù),第十四頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第十五頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第十六頁(yè)，共九十四頁(yè)。,液體稀釋法 對(duì)未知樣品作10倍系列稀釋。選適宜的3個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液各取3ml，接種到3組共9支液體培養(yǎng)基試管中，每管接入1ml，培養(yǎng)一定(yīd236。ng)的時(shí)間后，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查MPN〔most probable number ，最近似數(shù)〕表，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)可計(jì)算出其中的活菌含量。 細(xì)胞混濁度的測(cè)定 估計(jì)細(xì)胞數(shù)目和粗重的一較快和適用的方法是使用混濁度測(cè)定法。一個(gè)細(xì)胞懸浮液用肉眼觀察是呈現(xiàn)渾濁的，這時(shí)因?yàn)楣饩€通過(guò)懸浮液時(shí)，細(xì)胞散射光線。存在的細(xì)胞數(shù)越多，分散的光線就越多，因此懸浮液濁度就越大。可以用光度計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)量混濁度，分光光度計(jì)和光度計(jì)射出的光線通過(guò)細(xì)胞懸浮液時(shí)，就可以檢測(cè)出沒(méi)有被細(xì)胞散射的光線。,第十七頁(yè)，共九十四頁(yè)。,3 微生物群體(qntǐ)生長(zhǎng)的規(guī)律,微生物的群體生長(zhǎng)規(guī)律 單細(xì)胞的微生物，如細(xì)菌、放線菌在液體培養(yǎng)基中，可以均勻地分布，每個(gè)細(xì)胞接觸的環(huán)境條件相同，都有充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，故每個(gè)細(xì)胞都迅速地生長(zhǎng)繁殖。霉菌多數(shù)是多細(xì)胞微生物，菌體呈絲狀，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖的情況與單細(xì)胞微生物不一樣，如果采取搖床培養(yǎng)，那么霉菌在液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)繁殖情況，近似于單細(xì)胞微生物。因液體被攪動(dòng)，菌絲處于分布比較均勻的狀態(tài)，而且菌絲在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中不會(huì)像在固體培養(yǎng)基上那樣(n224。y224。ng)有分化現(xiàn)象，孢子產(chǎn)生也較少。 〔1〕典型的生長(zhǎng)曲線 微生物生長(zhǎng)繁殖的速度非常快，一般細(xì)菌在適宜的條件下，大約20~30分鐘就可以分裂一次，如果不斷迅速地分裂，短時(shí)間內(nèi)可達(dá)驚人的數(shù)目，但實(shí)際上是不可能的。,第十八頁(yè)，共九十四頁(yè)。,在培養(yǎng)條件保持穩(wěn)定的狀況下，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液中微生物的菌體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的開(kāi)始階段，菌體數(shù)目并不增加，一定時(shí)間后，菌體數(shù)目就增長(zhǎng)很快，繼而菌體數(shù)目增長(zhǎng)速度保持穩(wěn)定，最后增長(zhǎng)速度逐漸下降以致等于零。如果以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以單細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)目的對(duì)數(shù)值作縱坐標(biāo)，就可作出一條生長(zhǎng)曲線。這生長(zhǎng)曲線〔growth curve〕代表單細(xì)胞微生物從生長(zhǎng)開(kāi)始到衰老死亡的一般規(guī)律。 根據(jù)微生物的生長(zhǎng)速率常數(shù)〔growth rate constant〕，即每小時(shí)的分裂代數(shù)的不同，一般把典型的生長(zhǎng)曲線粗分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)時(shí)期。 〔一〕 延滯期〔lag phase〕 又叫適應(yīng)期、緩慢期或調(diào)整期，是指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液剛開(kāi)始的一段時(shí)間細(xì)胞數(shù)目不增加的時(shí)期，甚至細(xì)胞數(shù)目還可能減少。延滯期有如下(rxi224。)特點(diǎn)：〔1〕生長(zhǎng)的速率常數(shù)為零。〔2〕細(xì)胞的體積增大，DNA、含量增多為分裂做準(zhǔn)備?！?〕合成代謝旺盛，核糖體、酶類(lèi)和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶?！?〕對(duì)不良環(huán)境敏感，例如pH、NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等化學(xué)物質(zhì)。,第十九頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第二十頁(yè)，共九十四頁(yè)。,發(fā)酵工業(yè)中常常要采取措施縮短延滯期，其方法主要有： 〔1〕以對(duì)數(shù)期的菌體作種子菌， 〔2〕適當(dāng)增大接種量，生產(chǎn)上接種量的多少是影響延滯期的一個(gè)重要因素 ，接種量大，延滯期短，接種量小，那么延滯期長(zhǎng)。一般采用3~8%的接種量，最高不超過(guò)1/10。 〔3〕培養(yǎng)基的成分 為了縮短培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分差異，常常在種子培養(yǎng)基中參加生產(chǎn)培養(yǎng)基的某些營(yíng)養(yǎng)成分，即是種子培養(yǎng)基盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基。 〔二〕對(duì)數(shù)期〔logarithmic phase〕 又叫指數(shù)期，指在生長(zhǎng)曲線中，緊接著延滯期后的一段時(shí)期。此時(shí)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)的速率常數(shù)(ch225。ngsh249。)R最大，分裂快，細(xì)胞每分裂繁殖一次的增代時(shí)間〔即代時(shí)，generation time〕短，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體內(nèi)酶系活潑，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，細(xì)胞以驚人的速度產(chǎn)生，群體的形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境的能力強(qiáng)。,第二十一頁(yè)，共九十四頁(yè)。,圖312 生長(zhǎng)曲線(qūxi224。n)中的指數(shù)期,第二十二頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第二十三頁(yè)，共九十四頁(yè)。,在對(duì)數(shù)期中，以下三個(gè)參數(shù)尤為重要。 繁殖代數(shù)〔n〕由生長(zhǎng)曲線圖可以得出。P134 生長(zhǎng)速率常數(shù)〔R〕如前所述生長(zhǎng)速率常數(shù)的定義的可知 。 代時(shí)〔G〕 如前所述平均代時(shí)的定義可知。 影響微生物對(duì)數(shù)期增代時(shí)間的因素較多，主要有： 〔1〕菌種 ：不同微生物代時(shí)差異大，即使是同一菌種，由于培養(yǎng)基成分和物理(w249。lǐ)條件〔如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的pH和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)〕的不同，其對(duì)數(shù)期的代時(shí)也不同。但是，在一定條件下，各種菌的代時(shí)是相對(duì)穩(wěn)定的，多數(shù)為20~30分鐘，有的長(zhǎng)達(dá)33小時(shí)，快的只有分鐘左右。如表4 不同細(xì)菌的代時(shí)。,第二十四頁(yè)，共九十四頁(yè)。,第二十五頁(yè)，共九十四頁(yè)。,〔2〕 營(yíng)養(yǎng)成分 同種細(xì)菌(x236。jūn)，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其代時(shí)就短，反之那么長(zhǎng)。 〔3〕培養(yǎng)溫度 ：溫度是影響微生物生長(zhǎng)速率的重要物理因素。 在微生物的最適生長(zhǎng)溫度范圍時(shí)，代時(shí)就短。如表６14。 表６–14 大腸桿菌在不同溫度下的代時(shí),第二十六頁(yè)，共九十四頁(yè)。,(三) 穩(wěn)定期 〔stationary phase〕 一個(gè)單細(xì)胞重量約為110－12g,顯然，在指數(shù)生長(zhǎng)延長(zhǎng)到48小時(shí)之前，一定有一些物質(zhì)限制(xi224。nzh236。)了群體細(xì)胞生長(zhǎng)，因此進(jìn)入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期又叫最高生長(zhǎng)期或恒定期。處于穩(wěn)定期的微生物其特點(diǎn)是新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡細(xì)胞數(shù)幾乎相等，細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有凈增加或凈減少，即是正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)生長(zhǎng)速度逐漸趨向于零。 出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因主要有： 〔1〕營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的比例失調(diào)，例如C/N比值不適宜等； 〔2〕酸、醇、毒素或過(guò)氧化氫等有害代謝產(chǎn)物的累積； 〔3〕pH、氧化復(fù)原勢(shì)等環(huán)境條件越來(lái)越不適宜等。 在穩(wěn)定期雖然沒(méi)有出現(xiàn)生長(zhǎng)，但許多細(xì)胞功能包括能量代謝和某些生化合成過(guò)程都仍然在繼續(xù)，穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)