【正文】 第一篇：動(dòng)物檢疫現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用養(yǎng)殖宋天增201509510507 摘要：動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫主要檢測(cè)內(nèi)容包括動(dòng)物疫病、獸藥等有毒有害物質(zhì)、特定動(dòng)物源成份。本文簡(jiǎn)述了當(dāng)前動(dòng)物檢疫的主要檢測(cè)內(nèi)容、傳統(tǒng)常規(guī)動(dòng)物檢疫技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物檢疫中應(yīng)用和新型生物技術(shù)平臺(tái)技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：動(dòng)物檢疫；傳統(tǒng)檢疫技術(shù)；現(xiàn)代檢疫技術(shù)動(dòng)物檢疫（Animal Quarantine）遵照國(guó)家法律運(yùn)用強(qiáng)制性手段和科學(xué)技術(shù)方法預(yù)防或阻斷動(dòng)物疫病的發(fā)生以及從一個(gè)地區(qū)到另一個(gè)地區(qū)的傳播，通常指動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)的動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫人員依法對(duì)動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品的傳染病、寄生蟲(chóng)病進(jìn)行檢查定性和處理的行政執(zhí)法行為。通過(guò)動(dòng)物檢疫，對(duì)可疑或已證實(shí)的疫病對(duì)象實(shí)行強(qiáng)制隔離，或作出適當(dāng)處理，目的是防止動(dòng)物傳染病的傳播，保障畜牧業(yè)生產(chǎn)和人民健康。1動(dòng)物檢驗(yàn)主要檢測(cè)內(nèi)容動(dòng)物疫病（含人畜共患疫?。┯刹《?、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、支原體、非常規(guī)病原（例阮病毒、立克次氏體）引起，在動(dòng)物間或人與動(dòng)物間傳播，造成較嚴(yán)重危害的各種傳染病。我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物疫病名錄97種：一類(lèi)病15種，二類(lèi)病82種；含水生動(dòng)物疫病11種。OIE關(guān)注疫?。ㄊ謨?cè)2009）陸生動(dòng)物疫病112種；水生動(dòng)物疫?。?5種。動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品、飼料中的獸藥殘留、重金屬、微生物毒素、生物毒素等。獸藥包括禁用藥和限量用藥，具體檢測(cè)項(xiàng)目和控制標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)進(jìn)出口國(guó)家或地區(qū)的要求。瘋牛病傳播風(fēng)險(xiǎn)因子：飼料中的牛羊成分；動(dòng)物產(chǎn)品真?zhèn)舞b別：熟制肉類(lèi)出口；珍貴皮草、珍貴中藥材、瀕危動(dòng)物保護(hù)； 食物過(guò)敏源檢測(cè)：甲殼素、某些魚(yú)成份、轉(zhuǎn)基因成分：例轉(zhuǎn)基因魚(yú)等。2傳統(tǒng)常規(guī)動(dòng)物檢疫技術(shù)流行病學(xué)檢疫時(shí)，對(duì)流行病的分析和確診有至關(guān)重要的作用，但是流行病學(xué)的調(diào)查總結(jié)過(guò)程中也存在工作量大且繁瑣，耗費(fèi)的人力多等問(wèn)題。臨床檢疫方法具簡(jiǎn)便易行，適合現(xiàn)場(chǎng)操作等優(yōu)點(diǎn)，但是臨床檢疫對(duì)發(fā)病初期尚未出現(xiàn)有病證意義的、特征癥狀的病例，或非典型病例，或癥狀相似病例，往往難于做出診斷。病理學(xué)檢疫技術(shù)既可驗(yàn)證臨床診斷結(jié)果的正確與否，又可為實(shí)驗(yàn)室診斷方法和內(nèi)容的選擇提供參考依據(jù)。在剖解檢疫時(shí)，有些病例往往缺乏特征性的病變，特別是急性死亡的病例、非典型病例和早期屠 宰病例，所以在剖解檢疫這些病例時(shí)應(yīng)選擇癥狀較典型、病程較長(zhǎng)、未經(jīng)治療的自然死亡病例進(jìn)行剖檢。病原學(xué)檢疫時(shí)從病料中分離出病原微生物，雖是確診的重要依據(jù)，但健康動(dòng)物也有帶菌現(xiàn)象，所以病原學(xué)的檢疫結(jié)果還需與流行病學(xué)及臨床診斷癥狀、病理變化聯(lián)合起來(lái)綜合分析。而且任何一種病原學(xué)方法都存在有漏檢的可能，所以即使沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病原體，也不能完全否定該種傳染病的診斷。免疫學(xué)檢疫技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一。但酶聯(lián)免疫分析前期工作復(fù)雜，檢測(cè)對(duì)象針對(duì)性太強(qiáng)，開(kāi)發(fā)免疫檢測(cè)試劑盒所需費(fèi)用昂貴。3現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用是基于分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。根據(jù)生物大分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與相互作用原理，從分子水平檢測(cè)某種特定生物大分子存在與否。分子生物學(xué)檢疫又稱(chēng)基因檢疫，主要是針對(duì)不同病原微生物所具有的特異性核酸序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。自1976年以來(lái)，基因檢疫方法取得了巨大進(jìn)展，建立了DNA限制性?xún)?nèi)切酶圖譜分析、核酸電泳圖譜分析、寡核苷酸指紋圖核酸探針、聚合酶鏈反應(yīng)等。在動(dòng)物檢疫方面，具有代表性的技術(shù)主要有3大類(lèi)： 核酸擴(kuò)增技術(shù)：蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)：蛋白質(zhì)電泳與免疫印跡、重組抗原based、單克隆抗體based。新技術(shù)平臺(tái)：生物芯片、變性高效液相色譜、生物傳感器。核酸擴(kuò)增技術(shù)是對(duì)核酸進(jìn)行體外生成和放大的技術(shù)，只要起始的生物材料里存在微量的特定核酸（如某種病原體的核酸），通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)就能得到大量的可檢測(cè)到的特定核酸產(chǎn)物，從而可證明檢測(cè)對(duì)象的存在。主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)，實(shí)時(shí)熒光PCR，LAMP, NASBA核酸擴(kuò)增產(chǎn)物分析技術(shù)測(cè)序、雜交、酶切等。PCR與實(shí)時(shí)熒光PCR是發(fā)展成熟且主要應(yīng)用的核酸擴(kuò)增技術(shù)。 PCR檢測(cè)PCR技術(shù)用于動(dòng)物檢疫主要是檢測(cè)病原，做早期診斷和病原的鑒定。它不僅可以檢測(cè)活的病原體，而且還可檢出已滅活的病原體，只要病原體的核酸未降解。因此，當(dāng)由于各種原因無(wú)法進(jìn)行病原分離和鑒定時(shí)，該技術(shù)將發(fā)揮巨大的作用。常規(guī)PCR檢測(cè)過(guò)程包括：取樣、樣品前處理與核酸提取PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物的確證分析（測(cè)序、酶切等）。 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，每經(jīng)過(guò)一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，產(chǎn)生一個(gè)熒光信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)，也可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室及商業(yè)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)應(yīng)用的快速檢測(cè)方法。其優(yōu)點(diǎn)為：特異性好、靈敏度高、更快速；操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染；可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)；設(shè)備、試劑成本較高；快速篩選檢測(cè)方法，仍需確證（常規(guī)PCR及序列分析）等。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用范圍為重大動(dòng)物疫病及各種傳染病病原快速檢測(cè)方法，疫情監(jiān)控重要的技術(shù)依托；供港澳活禽及產(chǎn)品禽流感，新城疫監(jiān)測(cè)；進(jìn)境動(dòng)物產(chǎn)品口蹄疫，豬生殖與呼吸系統(tǒng)綜合癥檢測(cè)；動(dòng)物及產(chǎn)品甲型流感H1N1監(jiān)測(cè)；飼料及動(dòng)物產(chǎn)品中特定動(dòng)物源成分檢測(cè)等。（LAMP)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP)是在鏈置換DNA聚合酶啟動(dòng)下的鏈置換DNA合成循環(huán)。反應(yīng)起始階段形成DNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（LAMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)），以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)階段。擴(kuò)增產(chǎn)物是不同長(zhǎng)度的DNA混合物，分別具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物DNA序列為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列，酶切后可得到單一產(chǎn)物。需針對(duì)靶基因的6個(gè)特異序列設(shè)計(jì)4條引物，還可加上2條環(huán)識(shí)別引物以提高速度和產(chǎn)量。LAMP優(yōu)點(diǎn)為簡(jiǎn)便、成本低、更快速；設(shè)備和試劑成本低，時(shí)間短；高特異性、高靈敏度；識(shí)別6個(gè)區(qū)域的4條引物；敏感性比常規(guī)PCR高；高產(chǎn)量、易檢測(cè)；產(chǎn)量可達(dá)數(shù)十微克，可進(jìn)行熒光檢測(cè)（熒光核酸染料）或濁度（焦磷酸鎂沉淀）檢測(cè)。適合基層實(shí)驗(yàn)室甚至現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。LAMP缺點(diǎn)：更易污染、不方便產(chǎn)物回收及鑒定、設(shè)計(jì)空間較受限、擴(kuò)增產(chǎn)度 500時(shí)不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈擴(kuò)增。 核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀核酸檢測(cè)技術(shù)直接應(yīng)用于檢測(cè)各種動(dòng)物病原、病原體分型，特定動(dòng)物源成份、轉(zhuǎn)基因成份等，并已有一批總局明文批準(zhǔn)采用的檢測(cè)項(xiàng)目如：禽流感、甲型流感H1N口蹄疫、SARS、鏈球菌、藍(lán)耳病、轉(zhuǎn)基因、動(dòng)物源成份等。近幾年發(fā)布（或立項(xiàng)）不少檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（PCR/rPCR)，基本覆蓋主要進(jìn)境動(dòng)物疫病項(xiàng)目。核酸檢測(cè)技術(shù)在直屬局實(shí)驗(yàn)室（中心）均已開(kāi)展應(yīng)用或研發(fā)，設(shè)備和技術(shù)基礎(chǔ)良好。國(guó)內(nèi)外均有成熟的核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)和商業(yè)服務(wù)平臺(tái)（設(shè)備、試劑、技術(shù)服務(wù)）；常見(jiàn)病原體已有商品化核酸檢測(cè)試劑盒；基本上較重要的各種動(dòng)物病原體均有已發(fā)表的PCR檢測(cè)方法，全系統(tǒng)普遍具備自行開(kāi)發(fā)建立特定病原的核酸檢測(cè)方法的能力。 基因工程、單克隆抗體與蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)基因工程、單克隆抗體與蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)特異抗原（重組抗原）、單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)特異抗體等，該方法的建立基于重組抗原或單克隆抗體的各種血清學(xué)檢測(cè)方法：ELISA、膠體金試紙條、生物芯片等?；蚬こ?、單克隆抗體與蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)是系統(tǒng)內(nèi)研究開(kāi)發(fā)檢測(cè)方法/檢測(cè)試劑盒的熱點(diǎn)方向之一。隨著科技進(jìn)步和學(xué)科的交融，分子生物學(xué)、材料科學(xué)、微電子、激光檢測(cè)、計(jì)算機(jī)數(shù)字信號(hào)處理等多學(xué)科技術(shù)相融合，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、高通量（同步檢測(cè)多種目標(biāo)，或同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品）和自動(dòng)化檢 測(cè)和數(shù)據(jù)處理。伴隨著“人類(lèi)基因組計(jì)劃”而衍生的一項(xiàng)重大高新技術(shù)，通過(guò)微加工和微電子等技術(shù)在載體表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測(cè)。1992年第一塊生物芯片誕生，在近幾年迅速崛起，全球約有數(shù)百家生物技術(shù)公司和數(shù)千家研究機(jī)構(gòu)從事生物芯片的研究和開(kāi)發(fā)工作。生物芯片技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)與芯片技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一項(xiàng)高新技術(shù)?；蛐酒苽浼皺z測(cè)流程，是利用原位合成法或?qū)⒁押铣珊玫囊幌盗泄押烁仕嵋灶A(yù)先設(shè)定的排列方式固定在固相支持介質(zhì)表面，形成高密度的寡核甘酸的陣列，樣品與探針雜交后，由特殊的裝置檢出信號(hào)，并由計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析得到結(jié)果，其在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及動(dòng)物產(chǎn)品中的微生物的檢疫有廣泛的運(yùn)用。美國(guó)是生物芯片技術(shù)最為領(lǐng)先的國(guó)家，目前美國(guó)生物技術(shù)公司研制的生物芯片已進(jìn)入實(shí)用化、產(chǎn)業(yè)化階段。我國(guó)正式進(jìn)入生物芯片的研究領(lǐng)域是在1998年，我國(guó)自主研發(fā)的各類(lèi)生物芯片及其配套產(chǎn)品累計(jì)實(shí)現(xiàn)的銷(xiāo)售收入已超過(guò)億元人民幣。以生物芯片為核心的相關(guān)產(chǎn)業(yè)正在全球崛起!生物芯片主要包括：按檢測(cè)目標(biāo)：基因芯片、蛋白芯片（包括藥殘檢測(cè)芯片）、組織芯片、細(xì)胞芯片、糖芯片；按載體：固相芯片、液相芯片。在動(dòng)物間一種生物芯片主要用于：傳染?。ㄍ綑z測(cè)多種病原體；同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品）；藥物殘留（同時(shí)檢測(cè)多種藥物）；轉(zhuǎn)基因成分、特定動(dòng)物源成分（同時(shí)檢測(cè)鑒別多種成分）。（xMAP懸浮芯片技術(shù)）21世紀(jì)初誕生、在流式細(xì)胞術(shù)、ELISA技術(shù)和芯片技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的新一代分子診斷技術(shù)平臺(tái)，有機(jī)整合了微球（Beads）、激光檢測(cè)技術(shù)、流體動(dòng)力學(xué)、高速的數(shù)字信號(hào)處理系統(tǒng)和強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)運(yùn)算功能，具有更強(qiáng)的檢測(cè)特異性和靈敏性。液相芯片（xMAP懸浮芯片技術(shù)）核心技術(shù)是乳膠微球包被和熒光色編碼以及液相分子雜交，檢測(cè)速度極快，約十幾分鐘可完成檢測(cè)。乳膠微球帶有獨(dú)特的色彩編號(hào)，每種小球可分別包被抗原、抗體或核酸等特異分子，小球體懸浮于液相體系中構(gòu)成液相芯片系統(tǒng)，可以特異捕獲多達(dá)100種不同的目標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)同步特異檢測(cè)，其結(jié)果可在瞬間經(jīng)激光判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來(lái)，敏感性顯著超越抗原抗體結(jié)合酶聯(lián)信號(hào)或常規(guī)核酸雜交信號(hào)檢測(cè)。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)快速、靈敏度高；通量大；可進(jìn)行多元化分析，靈活性好；采用接近生物系統(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的完全液相反應(yīng)體系，穩(wěn)定性好；操作簡(jiǎn)便，不需洗滌，耗時(shí)短等。（DHPLC)技術(shù)變性高效液相色譜（DHPLC)技術(shù)近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高性?xún)r(jià)比核酸檢測(cè)分析技術(shù)，可進(jìn)行核苷酸片段分離分析、分析檢測(cè)已知或未知基因突變及SNP。被譽(yù)為“分子生物學(xué)新技術(shù)平臺(tái)”、“臨床基因診斷最佳技術(shù)平臺(tái)”。設(shè)備依托：Transgenomic公司的WAVE174。核苷酸片段分析系統(tǒng)利用離子對(duì)反相液相色譜原理進(jìn)行核酸片段的分離和分析。DNA SepCartridge分離柱采用無(wú)孔多苯乙烯二乙烯基苯（PSDVB）共聚物微球 體作為穩(wěn)定基質(zhì)，當(dāng)DNA樣品注入到色譜柱后，通過(guò)與緩沖液中的橋分子三乙基胺(TEAA)的相互作用被吸附到固相柱基質(zhì)上，而乙腈可破壞這一相互作用；通過(guò)改變流動(dòng)相中乙腈的濃度實(shí)現(xiàn)DNA片段的分離。DHPLC技術(shù)特點(diǎn)是檢測(cè)準(zhǔn)確性高，可分辨單個(gè)堿基的差異；操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化分析；結(jié)果重復(fù)性高，速度快；樣品通量高；消耗品低價(jià)性，性?xún)r(jià)比高。 生物傳感器（Biosensor）生物傳感器（Biosensor）是將生物體的成份（酶、抗原、抗體、DNA、激素）或生物體本身（細(xì)胞、細(xì)胞器、組織）固定化在一器件上作為敏感元件的傳感器稱(chēng)為生物傳感器。其工作原理是待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識(shí)別而發(fā)生生物學(xué)作用，產(chǎn)生的信息如光、熱、音等被相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?hào)，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，以電極測(cè)定其電流值或電壓值，從而換算出被測(cè)物質(zhì)的量或濃度。根據(jù)生物分子識(shí)別元件上的敏感材料可分為：酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、基因傳感器、細(xì)胞及細(xì)胞器傳感器。生物傳感器可監(jiān)測(cè)多種細(xì)菌、病毒、生物毒素。能在10s內(nèi)偵檢出微量級(jí)生化戰(zhàn)劑，包括委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、黃熱病毒、炭疽桿菌、流感病毒、鼠疫耶爾森菌、埃博拉出血熱病毒、肉毒桿菌類(lèi)毒素等；農(nóng)藥、獸藥殘留（農(nóng)產(chǎn)品、食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)）等方面。科技進(jìn)步使各種用途的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)室設(shè)備得以被發(fā)明制造并迅