基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-powerpoint演示文稿(已修改)
2025-01-15 17:43 本頁面
【正文】 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ) 限制性核酸內(nèi)切酶 ＤＮＡ連接酶 DNA聚合酶 限制性核酸內(nèi)切酶 （ restriction endonuclease） 。 是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸內(nèi)切酶。 寄主控制的限制（ restriction） 與修飾 (modification) 現(xiàn)象： 人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（ R/M體系）。 細(xì)菌的 R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的 DNA與外來的 DNA，并能使后者降解掉。 ?R/M體系： 寄主是由兩種酶活性配合完成的 一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶 另一種是核酸內(nèi)切限制酶 EcoB核酸酶和 EcoB甲基化酶 當(dāng) λ(k) 噬菌體侵染 ，由于其 DNA中有 EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而 DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在 EcoB甲基化酶的作用下，催化 S腺苷甲硫氨酸（ SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。 R/M體系的作用： 保護(hù)自身的 DNA不受限制； 破壞外源 DNA使之迅速降解 ? 限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。由于 R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。 ? 根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶、 Ⅱ 型酶、 Ⅲ 型酶 Ⅰ 型酶： 1968年， 。 分子量較大，反應(yīng)需 Mg++、 S腺苷酰 L甲硫氨酸（ SAM）、 ATP等。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。 Ⅱ 型酶 1970年， 血 Rd株中分離出來的限制酶。 分子量較?。?105Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。 ? 識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。 ? 許多 Ⅱ 型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。 Ⅲ 型酶 這類酶可識(shí)別特定堿基順序 ， 并在這一順序的 3’ 端 24~26bp處切開ＤＮＡ ， 所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的 。 Ⅱ 型酶的基本特性 1. 在 DNA雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割 DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂。 2. 兩個(gè)單鏈斷裂部位在 DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的 3. 因此，斷裂的結(jié)果形成的 DNA片斷，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。 核酸內(nèi)切酶作用后的斷裂方式 粘性末端 ：兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心，這樣形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的 DNA片斷。 具有 3’ OH（ Pst1 ），或 5’ OH(EcoR1)的粘性末端。 Pst1 EcoR1 5’ CTGCAG 3’ 5’ GAATTC 3’ 3’ GACGTC 5’ 3’ CTTAAG 5’ 平末端 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的 DNA片斷。不易重新環(huán)化。 同裂酶（ isoschizomers) 指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的 敏感性不同。 Example: 限制酶 HpaⅡ 和 MspⅠ 是一對(duì)同裂酶 (CCGG) ，當(dāng)靶序列中一個(gè) 5甲基胞嘧啶時(shí) HpaⅡ 不能進(jìn)行切割，而 MspⅠ 可以。 同尾酶（ isocaudamer） 指來源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。 雜種位點(diǎn)（ hybrid site）：由一對(duì)同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。 一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A C CTAG G A CTAG T 雜種位點(diǎn)（ hybrid site） 由一對(duì)同尾酶分別 產(chǎn)生的粘性末端共價(jià)結(jié)合形成的位點(diǎn)。 一般不能被原來的任何一種同尾酶識(shí)別。 BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A C CTAG G A CTAG T 雜種位點(diǎn) ： GATC C （ BamHⅠ ） CTAG T（ BclⅠ ） 限制片斷的末端連接作用 分子間的連接：不同的 DNA片斷通過互補(bǔ)的粘性末端之間的堿基配對(duì)而彼此連接起來。 分子內(nèi)的連接：由同一片斷的兩個(gè)互補(bǔ)末端之間的堿基配對(duì)而形成的環(huán)形分子。 限制酶的特性 DNA的來源無關(guān)； （對(duì)某種限制酶只具一個(gè)限制位點(diǎn)的質(zhì)粒）。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則： 第一個(gè)字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。 第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。 其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號(hào)。 羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。 例： EcoR I: 來自于 Escheria coli RY13的
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1