【正文】 現(xiàn)代微生物學(xué)技術(shù) Tel: 15861240818 Email: 1 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 010 100 1 緒論 2 2 微生物資源開(kāi)發(fā)和菌株選育 4 3 微生物育種技術(shù) 6 4 微生物發(fā)酵技術(shù) 6 5 醫(yī)藥微生物生物技術(shù) 4 6 環(huán)境微生物技術(shù) 6 7 農(nóng)業(yè)微生物生物技術(shù) 4 2 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 主要內(nèi)容 1 微生物工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 2 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)的基本概念 3 發(fā)酵過(guò)程的代謝控制 4 微生物發(fā)酵過(guò)程工藝參數(shù)控制 3 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 1 微生物工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ? 微生物發(fā)酵工藝的特點(diǎn) ? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中常用的術(shù)語(yǔ) ? 工藝優(yōu)化的方法和策略 4 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 微生物發(fā)酵工藝的特點(diǎn) ? 應(yīng)先因素眾多 ? 缺乏理論模型 ? 試驗(yàn)誤差較大 ? 影響因素間存在相互作用 5 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 試驗(yàn)設(shè)計(jì)中常用的術(shù)語(yǔ) ? 因素：試驗(yàn)中考察的對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)可能有影響的因素簡(jiǎn)稱因素。 ? 水平：每個(gè)因素在試驗(yàn)中要比較的具體條件稱為水平。 6 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 ? 工藝優(yōu)化研究的主要步驟： 篩選：因素多，不精確的知識(shí)，找出重要的影響因素； 優(yōu)化：因素少，在較適范圍內(nèi)，建立預(yù)言性模型 確證：使用預(yù)言的最優(yōu)成套條件，驗(yàn)證結(jié)果 7 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 常用的優(yōu)化方法 ? 單因子法：實(shí)驗(yàn)室最常用的優(yōu)化方法是單次單因子 (onevariableatatime)法，這種方法是在假設(shè)因素間不存在交互作用的前提下，通過(guò)一次改變一個(gè)因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐個(gè)因素進(jìn)行考察的優(yōu)化方法。但是由于考察的因素間經(jīng)常存在交互作用，使得該方法并非總能獲得最佳的優(yōu)化條件。另外，當(dāng)考察的因素較多時(shí)，需要太多的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期。所以現(xiàn)在的培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中一般不采用或不單獨(dú)采用這種方法，而采用多因子試驗(yàn)。 8 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 ? 多因子試驗(yàn) ? 多因子試驗(yàn)需要解決的兩個(gè)問(wèn)題 :(1)哪些因子對(duì)響應(yīng)具有最大 (或最小 )的效應(yīng)，哪些因子間具有交互作用。 (2)感興趣區(qū)域的因子組合情況，并對(duì)獨(dú)立變量進(jìn)行優(yōu)化 9 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ? 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是安排多因子的一種常用方法，通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可用少量的具有代表性的試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，較快地取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 ? 正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)就是選擇適當(dāng)?shù)恼槐?，合理安排?shí)驗(yàn)的分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種實(shí)驗(yàn)方法。具體可以分為下面四步：（ 1）根據(jù)問(wèn)題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；（ 2）根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設(shè)計(jì)正交表頭，并安排實(shí)驗(yàn)；（ 3）根據(jù)正交表給出的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（ 4）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選出較優(yōu)的“試驗(yàn)”條件以及對(duì)結(jié)果有顯著影響的因子。 ? 正交方法可以用來(lái)分析因素之間的交叉效應(yīng)，但需要提前考慮那些因素之間存在交互作用，再根據(jù)考慮來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。因此，沒(méi)有預(yù)先考慮的兩因素之間即使存在交互作用，在結(jié)果中也得不到顯示。 ? 對(duì)于多因素、多水平的科學(xué)試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，正交法需要進(jìn)行的次數(shù)仍嫌太多，在實(shí)際工作中常常無(wú)法安排，應(yīng)用范圍受到限制。 10 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì) ? 如果僅考慮“均勻分散”，而不考慮“整齊可比”，完全從“均勻分散”的角度出發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，叫做均勻設(shè)計(jì)。 ? 均勻設(shè)計(jì)按均勻設(shè)計(jì)表來(lái)安排實(shí)驗(yàn)，均勻設(shè)計(jì)表在使用時(shí)最值得注意的是均勻設(shè)計(jì)表中各列的因素水平不能像正交表那樣任意改變次序，而只能按照原來(lái)的次序進(jìn)行平滑，即把原來(lái)的最后一個(gè)水平與第一個(gè)水平銜接起來(lái)，組成一個(gè)封閉圈，然后從任一處開(kāi)始定為第一個(gè)水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平。 ? 均勻設(shè)計(jì)只考慮試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)均勻分布，因而可使所需試驗(yàn)次數(shù)大大減少。 11 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 PlackettBurman法 ? PlackettBunnan設(shè)計(jì)法是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，它試圖用最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因子的主效果得到盡可能精確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因子，供進(jìn)一步優(yōu)化研究用。 ? 該法不能考察各因子的相互交互作用。 12 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 部分因子設(shè)計(jì)法 ? 部分因子設(shè)計(jì)法與 PlackettBurman設(shè)計(jì)法一樣是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，能夠用比全因子實(shí)驗(yàn)次數(shù)少得多的實(shí)驗(yàn)，從大量影響因子中篩選出重要的因子。 ? 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合出一次多項(xiàng)式，并以此利用最陡爬坡法確定最大響應(yīng)區(qū)域，以便利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化。 13 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 響應(yīng)面分析（ response surface analysis，RSM） ? 方法是數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，和其他統(tǒng)計(jì)方法一樣，由于采用了合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以最經(jīng)濟(jì)的方式，用很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，科學(xué)地提供局部與整體的關(guān)系，從而取得明確的、有目的的結(jié)論。 ? 它與“正交設(shè)計(jì)法”不同，響應(yīng)面分析方法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子實(shí)驗(yàn)中，因子與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相互關(guān)系，用多項(xiàng)式近似，把因子與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（響應(yīng)值）的關(guān)系函數(shù)化，依此可對(duì)函數(shù)的面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)值之間，因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化。 14 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 2 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)的基本概念 發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)描述及速度概念 發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究的基本內(nèi)容 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的基本概念 菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)的基本概念 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的應(yīng)用 — 連續(xù)培養(yǎng)的操作特性 15 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） 發(fā)酵研究的內(nèi)容： 發(fā)酵過(guò)程反應(yīng)的描述 菌種的來(lái)源 ——找到一個(gè)好的菌種 發(fā)酵過(guò)程的工藝控制 ——最大限度發(fā)揮菌種的潛力 發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)描述及速度概念 16 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 基質(zhì)的消耗速度： dsrdt??dsdt? ??X發(fā)酵過(guò)程反應(yīng)速度的描述 基質(zhì)的消耗 比速 ： () (h s1) 單位時(shí)間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱為 比速 ，是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念。 X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） 17 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 dsdt? ??X基質(zhì)的消耗比速： (h1) 菌體的生長(zhǎng)比速： dxdt? ?X產(chǎn)物的形成比速： dpdt? ?X(h1) (h1) X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） 18 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 研究反應(yīng)速度及其影響因素并建立反應(yīng)速度與影響因素的關(guān)聯(lián) 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型 反應(yīng)器特性 + 反應(yīng)器的操作模型 操作條件與反應(yīng)結(jié)果的關(guān)系，定量地控制反應(yīng)過(guò)程 發(fā)酵反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究?jī)?nèi)容 19 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 已建立動(dòng)力學(xué)模型的類型 ? 機(jī)制模型： 根據(jù)反應(yīng)機(jī)制建立 幾乎沒(méi)有 ? 現(xiàn)象模型（經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停? 目前大多數(shù)模型 能定量地描述發(fā)酵過(guò)程 能反映主要因素的影響 20 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 微生物在一個(gè)密閉系統(tǒng)中的生長(zhǎng)情況： 時(shí)間 菌體濃度 延遲期 指數(shù)生長(zhǎng)期 減速期 靜止期 衰亡期 延遲期： dxdt ?0指數(shù)生長(zhǎng)期 : ??? max倍增時(shí)間 ： td 減速期 : ddt? ?0靜止期： 。 dxdt 0? maxXX衰亡期 : dxdt?0 微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的基本概念 21 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 微生物的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、 Monod方程 ? 微生物的生長(zhǎng)速度： μ＝ f(s,p,T,pH,……,) ? 在一定條件下 (基質(zhì)限制 )： μ＝ f(S) 22 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 Monod研究了基質(zhì)濃度與生長(zhǎng)速度的關(guān)系 ——— Monod方程 (1949) 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K m 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K mμ m a xsSKS????m a x sSvvKS? ?米氏方程 : 23 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K mm a xsSKS??? ? μ：菌體的生長(zhǎng)比速 S：限制性基質(zhì)濃度 Ks：半飽和常數(shù) μmax: 最大比生長(zhǎng)速度 μ 單一限制性基質(zhì)：就是指在培養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)物中，對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到限制作用的營(yíng)養(yǎng)物。 24 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 Monod方程的參數(shù)求解 (雙倒數(shù)法 )： 將 Monod方程取倒數(shù)可得： 1 1 1smm SK? ????sS KS? ??或： 這樣通過(guò)測(cè)定不同限制性基質(zhì)濃度下，微生物的比生長(zhǎng)速度，就可以通過(guò)回歸分析計(jì)算出 Monod方程的兩個(gè)參數(shù)。 m a xsKSS?? ? ?25 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 例 ： 在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)： S(mg/l) 6 33 64 153 221 μ(h1) 求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的 μ max， Ks和 td? 解：將數(shù)據(jù)整理： S/μ 100 S 6 33 64 153 221 smmS KS??? ??26 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 μmax， ＝ (h1)。 Ks＝ mg/L 0 100 2000100200300400?/ssm1 ? ?m k ?td＝ ln2/ μmax＝ h smmS KS??? ??27 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物 次級(jí)代謝產(chǎn)物： 還有一類產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞的代謝功能沒(méi)有明顯 的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等， 這一類化合物稱為次級(jí)代謝產(chǎn)物。 初級(jí)代謝產(chǎn)物： 微生物合成的主要供給細(xì)胞生長(zhǎng)的一類物質(zhì)。 如氨基酸、核苷酸等等，這些物質(zhì)稱為初級(jí) 代謝產(chǎn)物。 產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)的基本概念 28 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 Gaden對(duì)發(fā)酵的三分類與 Pirt方程： 〖一類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián) x p 29 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 〖二類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)部分偶聯(lián) x p 30 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 〖三類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)非偶聯(lián) x p 31 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 〖 Pirt方程〗 π＝ a + bμ ? a=0、 b≠0： 可表示一類發(fā)酵 ? a≠0、 b ≠ 0： 可表示二類發(fā)酵 ? a≠0、 b= 0： 可表示三類發(fā)酵 32 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 S S1 菌體 S2 產(chǎn)物 S3 維持 X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） +