【正文】 現(xiàn)代微生物學技術 Tel: 15861240818 Email: 1 淮海工學院海洋學院 010 100 1 緒論 2 2 微生物資源開發(fā)和菌株選育 4 3 微生物育種技術 6 4 微生物發(fā)酵技術 6 5 醫(yī)藥微生物生物技術 4 6 環(huán)境微生物技術 6 7 農(nóng)業(yè)微生物生物技術 4 2 淮海工學院海洋學院 主要內容 1 微生物工藝優(yōu)化的實驗設計 2 發(fā)酵過程動力學的基本概念 3 發(fā)酵過程的代謝控制 4 微生物發(fā)酵過程工藝參數(shù)控制 3 淮海工學院海洋學院 1 微生物工藝優(yōu)化的實驗設計 ? 微生物發(fā)酵工藝的特點 ? 試驗設計中常用的術語 ? 工藝優(yōu)化的方法和策略 4 淮海工學院海洋學院 微生物發(fā)酵工藝的特點 ? 應先因素眾多 ? 缺乏理論模型 ? 試驗誤差較大 ? 影響因素間存在相互作用 5 淮海工學院海洋學院 試驗設計中常用的術語 ? 因素：試驗中考察的對試驗指標可能有影響的因素簡稱因素。 ? 水平：每個因素在試驗中要比較的具體條件稱為水平。 6 淮海工學院海洋學院 ? 工藝優(yōu)化研究的主要步驟： 篩選：因素多，不精確的知識，找出重要的影響因素； 優(yōu)化：因素少，在較適范圍內，建立預言性模型 確證：使用預言的最優(yōu)成套條件，驗證結果 7 淮海工學院海洋學院 常用的優(yōu)化方法 ? 單因子法：實驗室最常用的優(yōu)化方法是單次單因子 (onevariableatatime)法，這種方法是在假設因素間不存在交互作用的前提下，通過一次改變一個因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐個因素進行考察的優(yōu)化方法。但是由于考察的因素間經(jīng)常存在交互作用，使得該方法并非總能獲得最佳的優(yōu)化條件。另外，當考察的因素較多時，需要太多的實驗次數(shù)和較長的實驗周期。所以現(xiàn)在的培養(yǎng)基優(yōu)化實驗中一般不采用或不單獨采用這種方法，而采用多因子試驗。 8 淮海工學院海洋學院 ? 多因子試驗 ? 多因子試驗需要解決的兩個問題 :(1)哪些因子對響應具有最大 (或最小 )的效應，哪些因子間具有交互作用。 (2)感興趣區(qū)域的因子組合情況，并對獨立變量進行優(yōu)化 9 淮海工學院海洋學院 正交實驗設計 ? 正交實驗設計是安排多因子的一種常用方法，通過合理的實驗設計，可用少量的具有代表性的試驗來代替全面試驗，較快地取得實驗結果。 ? 正交實驗的實質就是選擇適當?shù)恼槐?，合理安排實驗的分析實驗結果的一種實驗方法。具體可以分為下面四步：（ 1）根據(jù)問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；（ 2）根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設計正交表頭，并安排實驗；（ 3）根據(jù)正交表給出的實驗方案，進行實驗；（ 4）對實驗結果進行分析，選出較優(yōu)的“試驗”條件以及對結果有顯著影響的因子。 ? 正交方法可以用來分析因素之間的交叉效應，但需要提前考慮那些因素之間存在交互作用，再根據(jù)考慮來設計實驗。因此，沒有預先考慮的兩因素之間即使存在交互作用，在結果中也得不到顯示。 ? 對于多因素、多水平的科學試驗來說，正交法需要進行的次數(shù)仍嫌太多，在實際工作中常常無法安排，應用范圍受到限制。 10 淮海工學院海洋學院 均勻實驗設計 ? 如果僅考慮“均勻分散”，而不考慮“整齊可比”，完全從“均勻分散”的角度出發(fā)的實驗設計，叫做均勻設計。 ? 均勻設計按均勻設計表來安排實驗，均勻設計表在使用時最值得注意的是均勻設計表中各列的因素水平不能像正交表那樣任意改變次序，而只能按照原來的次序進行平滑，即把原來的最后一個水平與第一個水平銜接起來，組成一個封閉圈，然后從任一處開始定為第一個水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平。 ? 均勻設計只考慮試驗點在試驗范圍內均勻分布，因而可使所需試驗次數(shù)大大減少。 11 淮海工學院海洋學院 PlackettBurman法 ? PlackettBunnan設計法是一種兩水平的實驗優(yōu)化方法，它試圖用最少的實驗次數(shù)達到使因子的主效果得到盡可能精確的估計，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出最為重要的幾個因子，供進一步優(yōu)化研究用。 ? 該法不能考察各因子的相互交互作用。 12 淮海工學院海洋學院 部分因子設計法 ? 部分因子設計法與 PlackettBurman設計法一樣是一種兩水平的實驗優(yōu)化方法，能夠用比全因子實驗次數(shù)少得多的實驗，從大量影響因子中篩選出重要的因子。 ? 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)擬合出一次多項式，并以此利用最陡爬坡法確定最大響應區(qū)域，以便利用響應面法進一步優(yōu)化。 13 淮海工學院海洋學院 響應面分析（ response surface analysis，RSM） ? 方法是數(shù)學與統(tǒng)計學相結合的產(chǎn)物，和其他統(tǒng)計方法一樣，由于采用了合理的實驗設計，能以最經(jīng)濟的方式，用很少的實驗數(shù)量和時間對實驗進行全面研究，科學地提供局部與整體的關系，從而取得明確的、有目的的結論。 ? 它與“正交設計法”不同，響應面分析方法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子實驗中，因子與實驗結果的相互關系，用多項式近似，把因子與實驗結果（響應值）的關系函數(shù)化，依此可對函數(shù)的面進行分析，研究因子與響應值之間，因子與因子之間的相互關系，并進行優(yōu)化。 14 淮海工學院海洋學院 2 發(fā)酵過程動力學的基本概念 發(fā)酵過程的反應描述及速度概念 發(fā)酵過程動力學研究的基本內容 微生物生長動力學的基本概念 菌體生長、產(chǎn)物形成、基質消耗動力學的基本概念 反應動力學的應用 — 連續(xù)培養(yǎng)的操作特性 15 淮海工學院海洋學院 X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） 發(fā)酵研究的內容： 發(fā)酵過程反應的描述 菌種的來源 ——找到一個好的菌種 發(fā)酵過程的工藝控制 ——最大限度發(fā)揮菌種的潛力 發(fā)酵過程的反應描述及速度概念 16 淮海工學院海洋學院 基質的消耗速度： dsrdt??dsdt? ??X發(fā)酵過程反應速度的描述 基質的消耗 比速 ： () (h s1) 單位時間內單位菌體消耗基質或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱為 比速 ，是生物反應中用于描述反應速度的常用概念。 X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） 17 淮海工學院海洋學院 dsdt? ??X基質的消耗比速： (h1) 菌體的生長比速： dxdt? ?X產(chǎn)物的形成比速： dpdt? ?X(h1) (h1) X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） 18 淮海工學院海洋學院 研究反應速度及其影響因素并建立反應速度與影響因素的關聯(lián) 反應動力學模型 反應器特性 + 反應器的操作模型 操作條件與反應結果的關系，定量地控制反應過程 發(fā)酵反應動力學的研究內容 19 淮海工學院海洋學院 已建立動力學模型的類型 ? 機制模型： 根據(jù)反應機制建立 幾乎沒有 ? 現(xiàn)象模型（經(jīng)驗模型）： 目前大多數(shù)模型 能定量地描述發(fā)酵過程 能反映主要因素的影響 20 淮海工學院海洋學院 微生物在一個密閉系統(tǒng)中的生長情況： 時間 菌體濃度 延遲期 指數(shù)生長期 減速期 靜止期 衰亡期 延遲期： dxdt ?0指數(shù)生長期 : ??? max倍增時間 ： td 減速期 : ddt? ?0靜止期： 。 dxdt 0? maxXX衰亡期 : dxdt?0 微生物生長動力學的基本概念 21 淮海工學院海洋學院 微生物的生長動力學、 Monod方程 ? 微生物的生長速度： μ＝ f(s,p,T,pH,……,) ? 在一定條件下 (基質限制 )： μ＝ f(S) 22 淮海工學院海洋學院 Monod研究了基質濃度與生長速度的關系 ——— Monod方程 (1949) 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K m 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K mμ m a xsSKS????m a x sSvvKS? ?米氏方程 : 23 淮海工學院海洋學院 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K mm a xsSKS??? ? μ：菌體的生長比速 S：限制性基質濃度 Ks：半飽和常數(shù) μmax: 最大比生長速度 μ 單一限制性基質：就是指在培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物中，對微生物的生長起到限制作用的營養(yǎng)物。 24 淮海工學院海洋學院 Monod方程的參數(shù)求解 (雙倒數(shù)法 )： 將 Monod方程取倒數(shù)可得： 1 1 1smm SK? ????sS KS? ??或： 這樣通過測定不同限制性基質濃度下，微生物的比生長速度，就可以通過回歸分析計算出 Monod方程的兩個參數(shù)。 m a xsKSS?? ? ?25 淮海工學院海洋學院 例 ： 在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)： S(mg/l) 6 33 64 153 221 μ(h1) 求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的 μ max， Ks和 td? 解：將數(shù)據(jù)整理： S/μ 100 S 6 33 64 153 221 smmS KS??? ??26 淮海工學院海洋學院 μmax， ＝ (h1)。 Ks＝ mg/L 0 100 2000100200300400?/ssm1 ? ?m k ?td＝ ln2/ μmax＝ h smmS KS??? ??27 淮海工學院海洋學院 初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物 次級代謝產(chǎn)物： 還有一類產(chǎn)物，對細胞的代謝功能沒有明顯 的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等， 這一類化合物稱為次級代謝產(chǎn)物。 初級代謝產(chǎn)物： 微生物合成的主要供給細胞生長的一類物質。 如氨基酸、核苷酸等等，這些物質稱為初級 代謝產(chǎn)物。 產(chǎn)物形成動力學的基本概念 28 淮海工學院海洋學院 Gaden對發(fā)酵的三分類與 Pirt方程： 〖一類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長相偶聯(lián) x p 29 淮海工學院海洋學院 〖二類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián) x p 30 淮海工學院海洋學院 〖三類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長非偶聯(lián) x p 31 淮海工學院海洋學院 〖 Pirt方程〗 π＝ a + bμ ? a=0、 b≠0： 可表示一類發(fā)酵 ? a≠0、 b ≠ 0： 可表示二類發(fā)酵 ? a≠0、 b= 0： 可表示三類發(fā)酵 32 淮海工學院海洋學院 S S1 菌體 S2 產(chǎn)物 S3 維持 X S（底物） ─→ X （菌體） ＋ P（產(chǎn)物） +