【正文】 微生物轉(zhuǎn)化 ? UMBBD ? 第一章 微生物轉(zhuǎn)化方法 ? 從 20世紀 50年代開始，微生物學(xué)家通過有機化學(xué)、物理學(xué)、生物化學(xué)和遺傳基因?qū)W等學(xué)科的幫助，來研究了微生物代謝產(chǎn)物中的化學(xué)組成以及生命活動中酶和酶的化學(xué)反應(yīng)使生物學(xué)科向分子水平發(fā)展；同時也提供了微生物學(xué)向化學(xué)學(xué)科的滲透。微生物學(xué)研究者應(yīng)用現(xiàn)代的生物技術(shù)來幫助生物化學(xué)和有機化學(xué)工作者解決一些復(fù)雜和疑難的微生物代謝產(chǎn)物和化學(xué)合成的反應(yīng)．創(chuàng)造出不少人工合成的新化合物，推動了生物化學(xué)和有機化學(xué)的發(fā)展。 ? ? 微生物轉(zhuǎn)化是通過微生物細胞將復(fù)雜的底物進行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物特定部位 (基團 )進行的催化反應(yīng)。 ? 微生物作為一個生命體，其體積雖小，但有一套自身特異性的酶體系。在它的生長過程中有無數(shù)酶的參與，合成酶、水解酶、異構(gòu)酶、氧化酶、還原酶等都可能對加入其中的底物發(fā)生作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 ? 正因為微生物有著這獨特的優(yōu)點， 微生物轉(zhuǎn)化 就具備了生物量積累快、轉(zhuǎn)化時間短、轉(zhuǎn)化酶表達效率高、便于工業(yè)化生產(chǎn)的 特點。 ? 微生物轉(zhuǎn)化歷史悠久，早在 2500年前的春秋戰(zhàn)國時期，人們就已經(jīng)知道制醬和醋。在宋代，采用老的曲子進行接種，還根據(jù)酸大米和明礬水在較高溫下培養(yǎng)制造紅曲。不過當時人們并沒有認識到可以利用微生物來合成化學(xué)物質(zhì)。 ? 因此一般認為 微生物轉(zhuǎn)化 研究始于 1864年巴斯德利用乙酸桿菌將乙醇氧化為乙酸，但工業(yè)化微生物轉(zhuǎn)化的 重要里程碑 應(yīng)該是 20世紀 50年代美國普強藥廠的 Murray和 Peterson利用微生物黑根霉(Rhizonpus nigricans)的羥化酶將黃體酮轉(zhuǎn)化為11α羥基黃體酮，即對甾體化合物的結(jié)構(gòu)改造。 ? 利用微生物的作用來進行某種化學(xué)反應(yīng)稱為微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng) (microbial transformation or microbial bioconversion)。 ? 準確地說應(yīng)該是利用微生物代謝過程中某一個酶或者一組酶系對底物進行催化反應(yīng)稱為微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 ? 隨著生物學(xué)科進一步發(fā)展，特別是固定化細胞、誘變和基因重組等重要的生物技術(shù)的發(fā)展，不僅使得生物轉(zhuǎn)化成倍地提高轉(zhuǎn)化率，并且能將幾種不同合成基因構(gòu)建到同一個工程菌中使得一次培養(yǎng)同時進行幾步轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使微生物轉(zhuǎn)化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用。 第一節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng) ? 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進步，特別是固定化細胞、誘變和基因重組等的發(fā)展，使微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率成倍提高，也為天然藥物結(jié)構(gòu)修飾帶來了廣大的發(fā)展空間。 ? 不同類的微生物都含有不同的酶系?，F(xiàn)在將目前應(yīng)用和研究上用得比較多的微生物按化學(xué)反應(yīng)分類。 1．應(yīng)用于氧化反應(yīng) ? (1)脫氫反應(yīng) 應(yīng)用于脫氫反應(yīng)的主要是細菌 (2)羥基化反應(yīng) 應(yīng)用于羥基化反府的主要是放線菌 應(yīng)用于水解反應(yīng) ? 應(yīng)用于水解反應(yīng)的主要是細菌、酵母菌和霉菌 應(yīng)用于還原反應(yīng) ? 應(yīng)用于還原反應(yīng)的主要是酵母菌和霉菌。 應(yīng)用于酰基化反應(yīng) ? 應(yīng)用于?；磻?yīng)的主要是細菌 應(yīng)用于降解反應(yīng) ? 應(yīng)用于降解反應(yīng)的主要是細菌 應(yīng)用于脫水反應(yīng) ? 應(yīng)用于脫水反應(yīng)的主要是細菌和霉菌 第二節(jié)微生物轉(zhuǎn)化的一般過程 ? 微生物轉(zhuǎn)化實驗概要過程如下： 選擇需要的菌株 培養(yǎng)成熟菌絲或孢子 選擇合適的轉(zhuǎn)化方式 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)或轉(zhuǎn)化菌絲及孢子懸浮液轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化液的分離提取 產(chǎn)品純化 1． 選擇菌種 ? 選擇好的菌種是做好微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵；根據(jù)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的類型，選擇哪類微生物含這類反應(yīng)的酶。一般可以向國家或地方保管菌種機構(gòu)去函索取。 2. 制備培養(yǎng)基 ? 按微生物轉(zhuǎn)化菌種的培養(yǎng)特征和轉(zhuǎn)化反應(yīng)需要配制培養(yǎng)基；一般要求培養(yǎng)基的成分能使菌絲生長豐滿和富含需要的酶。 3 加轉(zhuǎn)他底物 ? 加底物時有兩個同等重要的影響因素：選擇合適的菌種生長期加底物；選擇加底物的方法和方式。 4 添加刺激劑或抑制劑 ? 添加抑制劑是抑制酶副反應(yīng)或抑制其他反應(yīng)不良酶的生長；添加刺激劑是提高酶活力和增加酶生長量。 5 控制好轉(zhuǎn)化反應(yīng)培養(yǎng)時間 ? 按有關(guān)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)各種因素，控制好轉(zhuǎn)化反應(yīng)培養(yǎng)終點電，使底物轉(zhuǎn)化達到最大反應(yīng)完全值。 6 調(diào)控好影響因素 ? 調(diào)控好整個轉(zhuǎn)化過程中各項影響因素。 7 控制好轉(zhuǎn)化反應(yīng)終點 ? 當取樣分析反映轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物積累不再增加時，立刻采用物理方法將菌絲體及培養(yǎng)物除去來停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 8 分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 ? 此時轉(zhuǎn)化產(chǎn)物已與生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)分開，可按化學(xué)方法將產(chǎn)物分離提純 第三節(jié)幾種常用的微生物轉(zhuǎn)化方法 ? 隨著固定化細胞、誘變和基因重組等重要的生物技術(shù)的發(fā)展，不僅使得微生物轉(zhuǎn)化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用，使生物轉(zhuǎn)化成倍地提高轉(zhuǎn)化率，并且使得微生物轉(zhuǎn)化方法更加豐富?，F(xiàn)在將幾種微生物轉(zhuǎn)化方法簡介如下。 分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法 ? 分批培養(yǎng) (batch culture)轉(zhuǎn)化法是在搖瓶和發(fā)酵罐中待菌體生長到一定階段加入底物進行轉(zhuǎn)化的方法。 ? 底物加入時間因菌種和底物不同而各異，一般在對數(shù)生長期，但也有在延遲期和穩(wěn)定期加入的。 利用酶進行生物轉(zhuǎn)化 ? 直接從微生物體內(nèi)或發(fā)酵液中將酶提出．在體外對底物進行生物催化。 ? 可以經(jīng)過多步處理得到純度較高的酶。也可以是粗酶。 ? 現(xiàn)在微生物來源的酶已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工及環(huán)保等行業(yè) 應(yīng)用滲透細胞進行生物轉(zhuǎn)化 ? 應(yīng)用滲透細胞進行生物轉(zhuǎn)化 主要 是促進底物滲入胞內(nèi)，與酶充分接觸，同時便于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物透出胞外，這種方法更適合于胞內(nèi)酶作用的生物轉(zhuǎn)化。 ? 增大細胞滲透性或改變細胞膜孔，一般采用表面活性劑或有機溶劑，有時也可利用抗生素來增加細胞膜的滲透性，但用量應(yīng)適當控制，以免殺死微生物。 應(yīng)用孢子進行生物轉(zhuǎn)化 ? 細菌的孢子一般無活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有較高的酶活力，與菌絲體比較具有雜質(zhì)相對少的優(yōu)點。 ? 孢子轉(zhuǎn)化 需要注意的是不能讓孢子萌芽 ，否則不能保持穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化活力。 ? 應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化的孢子懸浮液和培養(yǎng)基成分與靜止細胞轉(zhuǎn)化法相似．也是 采用不完全培養(yǎng)基， 僅含有緩沖液及葡萄糖等產(chǎn)生能量的碳源。 應(yīng)用固定化細胞進行生物轉(zhuǎn)化 ? 固定化細胞在適宜的轉(zhuǎn)化條件下進行生物轉(zhuǎn)化能保持細胞相對活的狀態(tài)，它的 最大優(yōu)點是 可以長期反復(fù)使用，有的能維持有效催化達數(shù)月之久。 ? 另外使用固定化細胞還使得產(chǎn)物提取簡單，便于自動化和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。 ? 目前常用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合法和卡拉膠包埋法。 應(yīng)用干燥細胞進行生物轉(zhuǎn)化 ? 干燥細胞轉(zhuǎn)化法實際上是另一種靜息細胞轉(zhuǎn)化法，便于貯備隨時使用。干燥細胞的制備有以下兩種常用方法。 ? ① 冰凍干燥法 ：將培養(yǎng)好的菌絲液，通過離心或過濾，洗滌后獲得干凈的菌絲體并重新懸浮于稀的緩沖液或純水中，冰凍后抽真空，直接升華除去水分．得到蓬松的粉末。這種干燥菌絲體在冰凍保存的條件下可以保持活力達數(shù)年之久，適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。 ? ② 丙酮干粉制備法 ： ? 將菌絲體懸浮于一 20℃ 的丙酮中處理 3次，每次獲得泥漿狀的丙酮液，用抽氣過濾進行收集，最后用冷乙醚洗滌，以幫助洗去殘余的丙酮。 ? 丙酮干粉劑必須冰凍貯藏，以供隨時使用。 7 靜息細胞轉(zhuǎn)化法 ? 靜息細胞轉(zhuǎn)化法 是指將微生物培養(yǎng)至～定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于不完全培養(yǎng)基 (缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)，如氮源等 )中，使其處于不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，再加入底物，在適當?shù)臏囟?、pH和振蕩條件下進行轉(zhuǎn)化的方法。 ? 它是一種將生長影響減至最小的生物轉(zhuǎn)化方法。 第四節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點 ? 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可以用靜止地按洗滌細胞進行研究．也可以用發(fā)酵方式進行轉(zhuǎn)化以及應(yīng)用固定化細胞進行生產(chǎn)等。 ? 它跟酶法轉(zhuǎn)化和有機化學(xué)轉(zhuǎn)化比較有以下特點 反應(yīng)條件溫和、公害少、設(shè)備簡單且反應(yīng)速度快 ? ① 在微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)中一般無需高壓、強熱等比較苛刻的條件，只需在常溫和 pH為 7左右的環(huán)境下進行反應(yīng)即可； ? ② 原料除了普通的培養(yǎng)基和底物外沒有其他化學(xué)品，一般普遍認為公害比較少； ? ③ 設(shè)備簡單，反應(yīng)條件比較溫和，生產(chǎn)安全。 ? ④ 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是酶催化的反應(yīng)。在最合適條件下，一秒內(nèi)酶能催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的分子個數(shù)數(shù)量級是 102～ lO6 可以減少反應(yīng)步驟 ? 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，酶合成基因構(gòu)建的基因工程菌可以把需要幾步催化合成的中間體在一次發(fā)酵中轉(zhuǎn)化完成。 ? 將幾步中間體合成的酶通過基因構(gòu)建到同一工程菌中，使在發(fā)酵法轉(zhuǎn)化時需要幾步催化臺成的中間體只要一步就可以轉(zhuǎn)化成功。 ? 如維生素 c生物合成中基因重組葡萄糖酸氧化桿菌的代謝工程菌，將 L山梨醇脫氫酶基因和 L山梨酮脫氫酶基因，通過基因重組構(gòu)建出一個工程菌株，發(fā)酵過程可以在同一次轉(zhuǎn)化發(fā)酵中將 D一山梨醇轉(zhuǎn)化成 α一酮一 L古洛糖酸。 對立體結(jié)構(gòu)合成上具有高度的專一選擇性 ? 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)其實也是一種酶反應(yīng)．對底物作用時，具有高度的立諱一構(gòu)選擇性。 ? 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)不僅對結(jié)構(gòu)有化學(xué)選擇性，還有區(qū)域選擇性、面選擇性和對映異構(gòu)選擇性。 ? 嚴格的立體結(jié)構(gòu)選擇性對天然藥物微生物轉(zhuǎn)化來說是非常重要的。 ? 因為藥物的異構(gòu)不僅無用或者低效，并且會帶來副作用，有時會有相反的藥效和強力的毒性。 ? 特別是生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等藥物的藥效對對映體結(jié)構(gòu)的要求很高，往往具有嚴格對映體結(jié)構(gòu)要求，這是有機化學(xué)合成等方法根難達到的。 回收率高、成本低 ? 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在細胞內(nèi)進行，保持原來整體酶系比較符合生物催化所需環(huán)境和條件。 ? 在氧化一還原等催化反應(yīng)時不需要添加輔酶；輔酶往往很不穩(wěn)定，難以分離提取，從這點來說微生物轉(zhuǎn)化比酶法轉(zhuǎn)化要好多了。 ? 微生物 反應(yīng)可以持續(xù)進行、反應(yīng)量大、回收率高并可以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。從設(shè)備和原料方面來說生產(chǎn)成本低于酶法和化學(xué)合成法 第二章 微生物轉(zhuǎn)化的影