【正文】 新型疫苗 一、轉(zhuǎn)基因植物疫苗 疫苗的研究和開發(fā)歷程 ? 以全細胞疫苗為標志的第一次疫苗革命 ? 以乙型肝炎基因工程疫苗為典型代表的第二次疫苗革命 ? 第三次疫苗革命 :基因疫苗研究 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的技術(shù)基礎(chǔ) ? 重組基因技術(shù) ? 實際上是重組 DNA疫苗的一種 ? 生產(chǎn)疫苗的系統(tǒng) :高等植物 ? 轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗，例如水果、黃瓜、胡蘿卜和番茄等 ? 轉(zhuǎn)基因的植物疫苗具有效果好、成本低、易于保存和免疫接種方便等優(yōu)點，因此特別適合于包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家的需要。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究方向 ? 一種是利用植物作為工廠采生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)抗原，然后經(jīng)過分離和提純，再制備成疫苗； ? 另一種是不需要分離和提純，將植物或其某部分作為可以直接口服的疫苗。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的優(yōu)越性 (1)植物細胞的全能性 植物的組織或原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)培養(yǎng)能得到一株完整的可育的植物體。 (2)完整的真核細胞表達系統(tǒng) 在植物中表達的產(chǎn)物可進行糖基化、酰胺化、磷酸化和亞基的正確裝配等翻譯后的加工過程，使表達產(chǎn)物具有與高等動物細胞表達一致的免疫原性及生物活性。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的優(yōu)越性 (3)誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng) 口服植物疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生粘膜分泌性 IgA。人體粘膜是阻擋某些病原體與人體接觸的第一道屏障。粘膜免疫的產(chǎn)生對某些傳染病，尤其是通過粘膜傳播的傳染病的預(yù)防是非常有效的。 (4)生產(chǎn)簡便、成本低廉 用動物或微生物生產(chǎn)疫苗需要特殊的條件和設(shè)備，并需要冷藏和低溫運輸。植物種植是最經(jīng)濟的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。從消耗的能源來說，陽光是植物用之不盡的能源，營養(yǎng)來自土壤中的肥料、礦物質(zhì)和水，無需專門的設(shè)施和昂貴的設(shè)備。轉(zhuǎn)基因植物的種子可用以再生產(chǎn)和技術(shù)轉(zhuǎn)讓。非常適合發(fā)展中國家的需要。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的優(yōu)越性 (5)接種簡便 植物疫苗的接種途徑主要是口服，無需注射。如果給嬰幼兒喂服香蕉泥疫苗，不再受皮肉之痛苦，無疑會受到家長們的歡迎。 (6)安全性 植物疫苗在本質(zhì)上是人類的食品，因此安全可靠，無毒性和副作用，也無潛在的致病和致癌的危險性。 轉(zhuǎn)基因植物種類的選擇標準： ? 該植物可以在世界上較多地區(qū)，特別是發(fā)展中國家種植，并能獲得較高的產(chǎn)量； ? 容易給嬰幼兒喂服，并能獲得家長們的接受； ? 作為疫苗的植物可食用部位必須是可以生食的，并且有較高的蛋白質(zhì)含量 (1)煙草 ? 煙草一直是進行植物組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物，較為容易獲得轉(zhuǎn)基因植物。 ? 雖然煙草含有尼古丁等有害物質(zhì)，但其蛋白質(zhì)含量豐富，可通過純化技術(shù)獲得蛋白質(zhì)，所以較適合于如乙型肝炎等轉(zhuǎn)基因植物疫苗的生產(chǎn)及應(yīng)用研究。 (2)馬鈴薯 ? 遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)已經(jīng)建立，在很短時間內(nèi)即可獲得大量的轉(zhuǎn)基因植物； ? 可食用的塊莖組織特異性啟動子已被克隆，可以使外源基因在塊莖內(nèi)特異地大量表達。 ? 組織培養(yǎng)快速繁殖系統(tǒng)業(yè)已成熟，可以供應(yīng)大量遺傳背景一致的種苗。 ? 馬鈴薯可以作為很多動物的食物，所以動物實驗絕無問題。 ? 致命的缺點 :即馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的含量較低，而且人類無生食馬鈴薯的習(xí)慣。 (3)香蕉 ? 在發(fā)展中國家有大量的種植，而且價格非常便宜。 ? 每個香蕉可以表達 1～ 10mg左右的外源基因蛋白質(zhì)，大約 100～ 500μg的蛋白質(zhì)抗原就足以刺激人體產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng)，因而一個轉(zhuǎn)基因的香蕉疫苗就能給 10個嬰幼兒進行口服免疫接種。 其他植物 ? 豆類植物的種子雖然含有較高的蛋白質(zhì)，而且轉(zhuǎn)基因豆類作物的研究也有較多成功的報道。但是豆類種子中含有凝集素類物質(zhì)，因而不能生食。 ? 大部分蔬菜和水果類植物含有較多的水分，蛋白質(zhì)的含量很低，顯然也很不適合作為轉(zhuǎn)基因植物疫苗的表達載體。 非直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗 乙型肝炎表面抗原疫苗 ? 目前市場上用的疫苗是用酵母細胞系統(tǒng)生產(chǎn)的 DNA重組乙肝病毒表面抗原疫苗 ? 將乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)入煙草的基因組 ,結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草成功表達了乙肝表面抗原。 乙型肝炎表面抗原疫苗 ? 發(fā)現(xiàn)煙草源性的乙肝表面抗原能夠產(chǎn)生抗乙肝表面抗原的抗體，除了 IgG1低于酵母源性疫苗外，IgG IgG IgM和 IgA的滴度均高于后者。這些抗體能識別人血清中的乙肝表面抗原。 ? 體外實驗也證明煙草源性的乙肝表面抗原保留了相同的 T細胞及 B細胞抗原決定簇。 ? 雖然煙草源性的乙肝表面抗原產(chǎn)生抗體比較慢，而且滴度略低于現(xiàn)有的疫苗，但煙草提取液只含 3％的蛋白質(zhì)，而酵母源性的疫苗卻是純化的蛋白質(zhì)制劑。 諾瓦克病毒衣殼蛋白 ? 引起腹瀉。 ? Mason等人用煙草來表達諾瓦克病毒衣殼蛋白取得成功。 ? 表達量達到煙葉總蛋白質(zhì)含量的 0． 23％。對這種植物源性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，它不但保留了抗原決定簇，而且能更加耐受蛋白酶的分解。在電鏡下觀察，其形狀類似于 NVLPs。 ? 用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯去喂小鼠，在小鼠血清中測到了抗諾瓦克病毒的 IgG和 IgA抗體。 狂犬病病毒糖蛋白 ? McGarvey等人將狂犬病病毒的表面蛋白在番茄中表達，且表明它能與病毒天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多克隆抗體形成免疫沉淀。 ? 他們還用植物病毒為載體得到狂犬病植物疫苗，并且在被免疫的小鼠血清中測到了中和抗體。 直接口服的轉(zhuǎn)基因植物疫苗 大腸桿菌腸毒素植物疫苗 ? 產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌引起腹瀉 ? 在感染性腹瀉的免疫機制中，粘膜免疫重要 ? 用轉(zhuǎn)基因植物作為口服疫苗有可能產(chǎn)生理想的粘膜免疫反應(yīng)，從而達到預(yù)防腹瀉性傳染病的目的。 ? Mason等人于 1995年根據(jù)這個原理將 LTB的編碼基因轉(zhuǎn)入煙草及馬鈴薯，研制成功轉(zhuǎn)基因植物疫苗 結(jié)核轉(zhuǎn)基因植物疫苗 ? 卡介苗 ? 結(jié)核 DNA疫苗已在小鼠實驗中獲得了可喜的免疫保護效果 ? 口服能表達結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)抗原的植物，有可能在肺部產(chǎn)生特異 IgA抗體等粘膜免疫反應(yīng) ? 把結(jié)核桿菌分泌性蛋白質(zhì) MPT64和 ESTA6基因?qū)藷煵荨ⅫS瓜、番茄和胡蘿卜的研究正在進行之中，其中 MPT64蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)在番茄中獲得了成功的表達。 動物傳染病的轉(zhuǎn)基因植物疫苗 ? 家畜都是生吃植物的，因而轉(zhuǎn)基因植物的選擇范圍比較廣。 ? Carrillo等報道了他們用編碼家畜口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP1的基因轉(zhuǎn)入到植物擬南芥中，然后用轉(zhuǎn)基因植物的葉子提取液來免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的特異性抗體能保護小鼠抵抗口蹄疫病毒的侵襲。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗研究的發(fā)展方向 ? 優(yōu)化重組基因 ? 無抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因植物 ? 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的穩(wěn)定性 優(yōu)化重組基因 ① 在插入基因的 3’端加上微粒體保留信號 SEKDEL多肽序列，使合成的蛋白質(zhì)能保留在細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部位，不會分泌出來，從而提高產(chǎn)量。 ②選擇特異的啟動子。花椰菜花葉病毒 35S啟動子是一個常用的啟動子，適合于多種植物。對馬鈴薯來說， patadin啟動子更為適合。在啟動子 3，端加上