【正文】 第三章 細菌和放線菌的基因重組和遺傳分析 ?真核微生物：基因重組涉及整個染色體 減數(shù)分裂 ?原核生物：基因重組僅涉及部分染色體或個別基因 轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導 第一節(jié) 轉(zhuǎn)化作用（ Transformation） ? 轉(zhuǎn)化：某一基因型細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一基因型細胞 DNA而使受體細胞基因型和表型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象。 A. Transformation Transfer of free DNA to a bacterial genome. free DNA free DNA recipient cell general rebination 一般重組 (同源重組 ) Transformant 轉(zhuǎn)化子 chromosome General rebination is not necessary because plasmids have origins of replication transformant free DNA (plasmid) TB Griffith in 1928, 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化現(xiàn)象 自然轉(zhuǎn)化的原核生物種類 ? 大腸桿菌 ? 肺炎雙球菌 ? 枯草芽孢桿菌 ? 流感嗜血菌 一、轉(zhuǎn)化作用的發(fā)現(xiàn) Griffith轉(zhuǎn)化研究 (1928) 二、轉(zhuǎn)化作用過程 受體細胞感受態(tài)出現(xiàn) 轉(zhuǎn)化因子的吸附和滲入 轉(zhuǎn)化因子的整合 感受態(tài)出現(xiàn) ?感受態(tài) (Competence) ：細菌從周圍環(huán)境吸收 DNA 分子，并且不易被細胞內(nèi)的限制性內(nèi)切酶分解時所處的一種特殊生理狀態(tài)。 ?處于感受態(tài)的細胞轉(zhuǎn)化率高 Competence :The capacity of cells to take up free DNA a. Some cells are naturally petent b. In some cells, petence can be induced by chemical and physical treatment c. In most cells, petence can be induced by electroporation. TB ? 感受態(tài)： 在特定生長階段或特定條件下出現(xiàn)，一般出現(xiàn)在細胞對數(shù)期后；不同細胞維持感受態(tài)時間不同； ? 實驗： 肺炎雙球菌抗鏈霉素菌株 DNA 轉(zhuǎn)化無抗性菌株 感受態(tài)誘導 ? 如果細胞沒處于感受態(tài)可以誘導： ? ①細胞由營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液 → 貧瘠的培養(yǎng)液 ? ②高濃度 CaCl2和改變溫度結(jié)合處理：適合于獨立的 DNA 復制子，如質(zhì)粒和病毒，轉(zhuǎn)化率很高。 ?對數(shù)生長期的 大腸桿菌 (受體菌 )懸浮于冰預冷的低滲 理 1530min ??? 使細菌細胞膜通透性增加（成為感受態(tài)細胞） ?向大腸桿菌中 加入外源 DNA，使之吸附于細胞表面 ??? 42℃ 短暫的 熱處理 ，促進外源 DNA進入感受態(tài)細胞 . 感受態(tài)誘導 (實驗 ) ③ 對于 不能自然形成感受態(tài)的細胞 ，可以采用 PEG（聚乙二醇）誘導轉(zhuǎn)化 , 這類細菌首先用細胞壁降解酶除去肽聚糖層，在 PEG存在下，質(zhì)粒和噬菌體 DNA可以 高效 導入原生質(zhì)體。 例如： Bacillus subtilis利用 PEG技術(shù)可以使 80%的細胞被轉(zhuǎn)化， 107轉(zhuǎn)化子 ?ug質(zhì)粒DNA。 ? ④ 對于 不能自然形成感受態(tài)的細胞，也不能誘導產(chǎn)生感受態(tài)的細胞 ，可以用 人工方法將核酸導入 ? 電擊穿孔轉(zhuǎn)化 ：用電轉(zhuǎn)化儀產(chǎn)生的高壓脈沖電流擊穿細胞膜形成小孔，使 DNA分子通過小孔瞬間進入細胞。小孔自動恢復原狀 . ? 該法適合于 原核細胞和真核細胞。 ? 對于 大腸桿菌 ， 109 1010轉(zhuǎn)化子 ?ugDNA. 電轉(zhuǎn)化儀（轉(zhuǎn)化細菌和真菌） 3)Transformation Application: Rebinant DNA technology 電擊杯 利用高壓氣體加速，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的受體細胞中。 He 利用 Gene gun轉(zhuǎn)化 DNA 二、轉(zhuǎn)化作用過程 受體細胞感受態(tài)出現(xiàn) 轉(zhuǎn)化因子的吸附和滲入 轉(zhuǎn)化因子的整合 轉(zhuǎn)化因子的吸附和滲入 ? 轉(zhuǎn)化因子 (線形 )首先吸附在感受態(tài)細胞表面凹陷處， ? 由核酸內(nèi)切酶作用將 DNA切成 45MD的片段， ? 再由核酸外切酶作用將雙鏈的一個單鏈分解， ? 另一單鏈與感受態(tài)特異蛋白 結(jié)合，進入細胞。 感受態(tài)特異蛋白 細胞分泌小蛋白 ,而導致細菌 感受態(tài)的形成 ,在營養(yǎng)缺乏的 饑餓狀態(tài)下，細胞易產(chǎn)生感 受態(tài)因子 在自然轉(zhuǎn)化中感受態(tài)因子與細胞表面 受體相互作用產(chǎn)生自溶素，自溶素可 使細胞表面的 DNA 結(jié)合蛋白和核酸酶 裸露。核酸酶可完全降解 DNA，所以 自然轉(zhuǎn)化很難發(fā)生。 轉(zhuǎn)化因子整合 1）受體 DNA部分雙鏈松開，供體和受體 DNA單鏈堿基配對 2）供體 DNA整合于受體染色體上，與之配對的受體 DNA單鏈被DNA酶降解 3）不與供體 DNA配對的另一條受體 DNA單鏈被切下降解 4）供體 DNA單鏈復制成雙鏈 細菌轉(zhuǎn)化 三、 轉(zhuǎn)化在遺傳分析中的應用 ? 基因連鎖檢測 ? 實驗：肺炎雙球菌 R/Amps（受體）和 S/Ampr型（供體）進行轉(zhuǎn)化。 ? S/AmprDNA + R/Amps → R/Amp r or S/AmpS ? 說明每次轉(zhuǎn)化 ,受體菌只能得到供體菌某一形狀 . ?共轉(zhuǎn)化 ：受體菌吸收外源 DNA 后，兩個遺傳形狀同時改變的現(xiàn)象。 ?共轉(zhuǎn)化的兩個基因可以是 連鎖或非連鎖 的關(guān)系。如何判斷兩個基因是不是連鎖關(guān)系 ？ ?根據(jù)轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生和供體 DNA的濃度關(guān)系進行判斷。 (1)如果 ab是連鎖的， 當DNA濃度下降時（下降10倍）， ab轉(zhuǎn)化頻率的下降趨勢與 a或 b相同（下降 10倍 ). (2)如果 ab是不連鎖的 ， ab轉(zhuǎn)化頻率是 a和 b的乘積；當 DNA濃度下降時， ab轉(zhuǎn)化頻率的下降將遠遠超過 a和 b（下降 100倍 ) 。 外源 DNA(a和 b基因 )轉(zhuǎn)化 遺傳學圖譜的繪制 ? 如果確定了兩個共轉(zhuǎn)化基因存在連鎖關(guān)系，可以根據(jù) 共轉(zhuǎn)化頻率 來進行基因定位 . ? 同一染色體片段兩個基因位置越近，共轉(zhuǎn)化頻率越高。 ? 共轉(zhuǎn)化頻率可以用共轉(zhuǎn)指數(shù)代表。 ? 共轉(zhuǎn)指數(shù) = a+b+ ／（ a+b+ ab+ +a+b+） ?