【正文】 微生物發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)王金華實(shí)驗(yàn)規(guī)則實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書。若經(jīng)提問(wèn)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有預(yù)習(xí)者，須在教師指定的時(shí)間內(nèi)預(yù)習(xí)完畢，方得參加實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前須認(rèn)真檢查儀器、試劑、用具及實(shí)驗(yàn)材料。如有破損、短缺應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，經(jīng)同意后方可調(diào)換和補(bǔ)充。對(duì)玻璃器皿須做好清洗工作。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不得隨便挪動(dòng)外組的儀器、用具和實(shí)驗(yàn)材料。不得隨意撥動(dòng)儀器開關(guān)或電源開關(guān)，須按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)材料、藥品的使用，應(yīng)在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下注意節(jié)約，杜絕浪費(fèi)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持肅靜，不得談笑喧嘩，不許搞其他動(dòng)作，以免影響他人實(shí)驗(yàn)。清洗儀器、用具、材料時(shí)，須將固形物倒入指定容器內(nèi)，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，須按操作規(guī)程仔細(xì)操作，注意觀察試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)及時(shí)記錄。不得抄寫他人的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)記錄，否則，須重做。如有疑問(wèn)，應(yīng)向指導(dǎo)教師詢問(wèn)清楚后方可進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)完畢后，須將玻璃儀器、用具等清洗干凈，按原來(lái)的位置擺設(shè)放置。如有破損須報(bào)告指導(dǎo)教師，并填寫儀器損壞登記簿。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不得隨意食用原料和加工品。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，由值日生負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室，保持室內(nèi)整潔，注意關(guān)上水、電、窗、門。實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制及滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆詹煌愋臀⑸锱囵B(yǎng)基的配方及其制備方法。二、儀器設(shè)備及原材料高壓滅菌鍋，250ml三角瓶，紗布，牛皮紙，瓊脂，其他化學(xué)藥品三、常用培養(yǎng)基的配方及制備細(xì)菌常用培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基 蛋白胨 %酵母膏 %NaCl %可溶性淀粉 %瓊脂 %pH ℃滅菌20min。（2）MRS（乳酸菌分離） %%蛋白胨1%葡萄糖1%%NaCl % 瓊脂2% 固體培養(yǎng)基加瓊脂2%；%酵母菌常用培養(yǎng)基（1）麥芽糖培養(yǎng)基 蛋白胨1%麥芽糖2% %瓊脂2%自然pH ℃滅菌20min。 霉菌常用培養(yǎng)基PDA（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基） 去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水1000ml煮沸30min出汁，三層紗布過(guò)濾，濾液中加入2%蔗糖，補(bǔ)充水至終體積1000ml，加瓊脂2%，自然pH。℃滅菌20min。四、實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題及討論 配制培養(yǎng)基操作過(guò)程中的問(wèn)題。 培養(yǎng)基滅菌操作過(guò)程中的問(wèn)題。 培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象，分析原因，討論解決方法。實(shí)驗(yàn)二 酸奶的釀制及乳酸菌的分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊髮W(xué)習(xí)并掌握酸奶制作的基本原理和方法。學(xué)習(xí)并掌握從酸奶中分離和純化乳酸菌的方法。二、基本原理酸奶是以牛乳為主要原料，接入一定量乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵后制成的一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊風(fēng)味的發(fā)酵乳制品飲料。通過(guò)乳酸菌發(fā)酵牛奶中的乳糖產(chǎn)生乳酸，當(dāng)產(chǎn)酸到一定程度時(shí)，乳酸使牛奶中酪蛋白(約占全乳的2．9％，占乳蛋白的85％)變性凝固而使整個(gè)奶液呈凝乳狀態(tài)。同時(shí)，通過(guò)發(fā)酵還可形成酸奶特有的香味和風(fēng)味(與形成乙醛、丁二酮等有關(guān))，并具有清新爽口的味覺(jué)。由于酸奶中含有乳酸菌的菌體及代謝產(chǎn)物，因而對(duì)腸道內(nèi)的致病菌有一定的抑制作用；對(duì)人體的腸胃消化道疾病也有良好的治療效果。三、器材乳酸菌種：自市售各種酸奶中分離 保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Strep． tococcus thermophilus) 培養(yǎng)基：（1）發(fā)酵培養(yǎng)基：市售鮮奶或用奶粉進(jìn)行配制（2）分離乳酸菌培養(yǎng)基：（任選一種）培養(yǎng)基→平板→劃線MRS分離培養(yǎng)基優(yōu)質(zhì)全脂奶粉（內(nèi)含脂肪28%，蛋白質(zhì)27%，乳糖37%，礦物質(zhì)6%，水分2%），白砂糖，蒸餾水。酸奶發(fā)酵瓶，封口膜，保鮮膜，不銹鋼鍋，鐵勺，塑料漏斗，無(wú)菌移液管（帶棉花），脫脂棉，牙簽，培養(yǎng)皿，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，冰箱等、溫度計(jì)四、操作步驟全脂乳粉、砂糖、水 混合均勻 預(yù)熱(6070℃) 均質(zhì)(1518MPa) 滅菌(8590℃，58min) 冷卻(4345℃) 接種 分裝 封口 菌種 活化 母發(fā)酵劑 生產(chǎn)發(fā)酵劑保溫發(fā)酵(4243℃，36h) 酸奶瓶 清洗 開水燙洗消毒 冷藏(2～5℃) 成 品酸奶的制作⑴調(diào)配與均質(zhì) 按1:7（:100ml）的比例加水（水質(zhì)要求： ～，硬度≤10度（德國(guó)度）），在45～50℃下把奶粉配制成復(fù)原牛奶，并加入10%白砂糖及適量（%）穩(wěn)定劑變性淀粉（使制成的酸奶口感飽滿，粘度高，抗機(jī)械剪切力強(qiáng)，使酸乳在輸送過(guò)程中保持良好狀態(tài)），高速混料，水合45 ～60min，防止氣泡產(chǎn)生。或用市售鮮牛奶加5%蔗糖調(diào)勻也可。⑵裝瓶 在250ml的酸奶發(fā)酵瓶中裝入牛奶200ml，裝瓶量80%。⑶滅菌 將裝有牛奶的發(fā)酵瓶置于80℃恒溫水浴鍋中用巴氏滅菌法10磅滅菌15min，或于90℃水浴中滅菌5min。⑷冷卻 將已滅菌的牛奶冷卻到4045℃。⑸接種 用無(wú)菌移液管以58%的接種量將市售酸奶接種入冷卻至4045℃的牛奶中，并充分搖勻。⑹培養(yǎng) 把接種后的發(fā)酵瓶置于4042℃溫箱中培養(yǎng)412h。%，凝乳完全形成并有少量乳清析出，表面有小顆粒（視情況而定，培養(yǎng)過(guò)程中切勿搖動(dòng)，以防乳塊散掉，不易重結(jié)）。⑺冷藏后熟 酸奶在發(fā)酵形成凝塊后，取出置17℃的低溫下冷藏1224h，后熟，以獲得酸奶的特有風(fēng)味和口感。⑻品味 品嘗自己制作的酸奶，判斷其感官品質(zhì)是否達(dá)到要求，若達(dá)不到要求，分析其原因。酸奶質(zhì)量的評(píng)定以品嘗為標(biāo)準(zhǔn)，通常有色澤、凝塊狀態(tài)，表層光潔度、酸度及香味、無(wú)異味等各項(xiàng)指標(biāo)。感官檢驗(yàn)試驗(yàn)方法① 色澤和組織狀態(tài)：取適量試樣于50mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。② 滋味和氣味：取適量試樣于50mL燒杯中，先聞氣味，然后用溫開水漱口，再品嘗樣品的滋味。品嘗時(shí)發(fā)現(xiàn)有異味則可判定污染了雜菌。⑼貯存 產(chǎn)品的貯存溫度為2℃~6℃。酸奶中乳酸菌的分離純化⑴倒平板培養(yǎng)基：將分離用培養(yǎng)基完全融化并冷卻到45℃左右倒平板，冷凝空白培養(yǎng)后備用。⑵稀釋：將待分離的酸奶進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取一定稀釋度的菌液做平板分離。⑶分離純化：乳酸菌的分離可采用新鮮酸奶進(jìn)行平板涂布分離，或直接用接種環(huán)蘸取酸奶作劃線分離。分離后，置于37℃下培養(yǎng)以獲得單菌落。⑷觀察菌落特征：經(jīng)23d培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成后，仔細(xì)觀察并區(qū)別不同類型的乳酸菌。酸奶中的各種乳酸菌在馬鈴薯汁牛奶培養(yǎng)基平板表面通常呈現(xiàn)三種形態(tài)特征的菌落：①扁平型菌落：大小為23mm，邊緣不整齊，很薄，近似透明狀，染色鏡檢為細(xì)桿菌；②半球狀隆起菌落：大小為12mm，隆起成半球狀，邊緣整齊且四周可見(jiàn)酪蛋白水解透明圈，染色鏡檢為鏈球狀；③禮帽形突起菌落：大小為12mm，邊緣基本整齊，菌落中央呈隆起狀，四周較薄，有酪蛋白透明圈，染色鏡檢呈鏈球狀。⑸單菌株發(fā)酵試驗(yàn)：若將上述單菌落接入牛奶，經(jīng)活化增殖后再以10%的接種量接入消毒后的牛奶中，分別于37℃和45℃下培養(yǎng)，各菌株的發(fā)酵液均可達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。若采用兩種菌株混合培養(yǎng)，則含菌量?？杀对觥＂势穱L：?jiǎn)沃臧l(fā)酵成的酸奶與混菌發(fā)酵成的酸奶相比較，其香味和口感都比較差。兩菌混合發(fā)酵又以球菌和桿菌等量混合接種所發(fā)酵成的酸奶為佳。 桿菌→產(chǎn)酶→分解蛋白質(zhì)→氨基酸球菌→產(chǎn)酸→蛋白質(zhì)變性→凝結(jié)成塊↓醇酯化→香味在制備酸奶時(shí)，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合物在40～50℃乳中發(fā)酵2~3h即可達(dá)到所需的凝乳狀態(tài)與酸度，而任何單一菌株的發(fā)酵時(shí)間都在10h以上，其原因就是因?yàn)楸＜永麃喨闂U菌與嗜熱鏈球菌之間存在互生現(xiàn)象。保加利亞乳桿菌在發(fā)酵的初期分解酪蛋白而形成氨基酸和多肽，促進(jìn)了嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)，隨著嗜熱鏈球菌的增加，酸度增加，抑制了嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)。嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)過(guò)程中，乳脲活動(dòng)產(chǎn)生CO甲酸刺激保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)。發(fā)酵的初期嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)的快；發(fā)酵1小時(shí)后與保加利亞乳桿菌的比例為(34):1。感官特性 應(yīng)符合表1的規(guī)定。 表1項(xiàng) 目純酸牛乳調(diào)味酸牛乳、果料乳牛乳色澤呈均勻一致的乳白色或微黃色呈均勻一致的乳白色，或調(diào)味乳、果料應(yīng)有的色澤滋味和氣味具有酸牛乳固有的滋味和氣味具有調(diào)味酸牛乳或果料酸牛乳應(yīng)有的滋味和氣味組織狀態(tài)組織細(xì)膩、均勻，允許有少量浮清析出；果料酸牛乳有果塊或果粒衛(wèi)生指標(biāo) 應(yīng)符合表2的規(guī)定。 表2項(xiàng) 目純酸牛乳調(diào)味酸牛乳果料酸牛乳苯甲酸，g/kg ≤山梨酸，g/kg 不得檢出≤硝酸鹽（以NaNO3計(jì)），mg /kg ≤亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)），mg/kg ≤黃曲霉毒素M1， μg /kg ≤大腸菌群，MPN/100Ml ≤90致病菌（指腸道致病菌和致病性球菌）不得檢出五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告將各批混菌發(fā)酵的酸奶品評(píng)結(jié)果記錄于下表中。批次品 評(píng) 項(xiàng) 目凝乳情況乳清淅出狀態(tài)稀薄粘度表面氣泡沫表面光澤口感酸度香味異味發(fā)粘pH結(jié)論1234將單菌和混菌發(fā)酵的酸奶品評(píng)結(jié)果記錄于下表中。單菌及混菌比例品 評(píng) 項(xiàng) 目pH結(jié)論凝乳情況口感香味異味桿 菌球 菌桿菌:球菌（1:1）桿菌:球菌（1:4）在制備酸奶時(shí)，為何混菌發(fā)酵比單一菌株發(fā)酵更優(yōu)越？雙岐桿菌的乳酸發(fā)酵途徑與明串珠菌的乳酸發(fā)酵途徑有什么不同? 實(shí)驗(yàn)三 甜酒釀的制作和酒藥中糖化菌的分離一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握甜酒釀的釀制方法，了解釀酒的基本原理。進(jìn)一步了解淀粉在糖化菌——根霉、毛霉和酵母菌作用下制成甜酒釀的過(guò)程。進(jìn)一步掌握微生物的分離、培養(yǎng)等基本方法和無(wú)菌操作技術(shù)。加深理解根霉或毛霉的形成特征。二、基本原理甜酒釀是將糯米經(jīng)過(guò)蒸煮糊化，接種后，在適宜的條件下（2830℃），讓種曲中的霉菌孢子萌發(fā)菌絲體，大量繁殖后通過(guò)酒藥（根霉、毛霉和酵母菌等微生物的混合糖化發(fā)酵劑）中的根霉和毛霉等微生物所產(chǎn)淀粉酶的作用將原料中糊化后的淀粉糖化，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，然后酒藥中的酵母菌利用糖化產(chǎn)物生長(zhǎng)繁殖，并通過(guò)酵解途徑將糖轉(zhuǎn)化成酒精，從而賦予甜酒釀特有的香氣、風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，甜酒釀中的糖分逐漸轉(zhuǎn)化成酒精，因而糖度下降．酒度提高，故適時(shí)結(jié)束發(fā)酵是保持甜酒釀口味的關(guān)鍵。要初步學(xué)會(huì)和掌握釀制方法并不困難，從微生物學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，釀制的關(guān)鍵在于：要有優(yōu)質(zhì)的酒釀種曲，即種曲中應(yīng)含有糖化率高的優(yōu)質(zhì)根霉、毛霉孢子或菌絲體；應(yīng)選擇優(yōu)質(zhì)的糯米作原料；嚴(yán)格無(wú)菌操作規(guī)程，盡量避免雜菌污染；合理控制釀制條件等。 以糯米(或大米)經(jīng)甜酒藥發(fā)酵制成的甜酒釀，是我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。我國(guó)釀酒工業(yè)中的小曲酒和黃酒生產(chǎn)中的淋飯酒在某種程度上就是由甜酒釀發(fā)展而來(lái)的。三、實(shí)驗(yàn)材料酒藥（）、糯米，馬鈴薯，蔗糖甜酒藥中糖化菌的分離培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基蒸鍋，紗布，1000ml燒杯，250ml廣口培養(yǎng)瓶，封口膜，保鮮膜，牛皮紙，天平，培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋、淘米盆、防水紙、繩子、涼開水，顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、解剖針、酒精燈、鑷子、培養(yǎng)皿等。四、操作步驟（一）甜酒釀的制作 酒 藥 洗米 蒸飯 淋水 降溫 落缸搭窩 發(fā)酵 甜酒釀浸米與洗米：選擇優(yōu)質(zhì)新鮮糯米，淘洗干凈后浸泡過(guò)夜，使米粒中的淀粉粒子吸水膨脹，便于蒸煮糊化，清水沖洗至水清亮，撈起瀝干。 隔水蒸煮：將糯米放在蒸鍋內(nèi)擱架的紗布上隔水蒸煮，15磅1020min，常壓30min，至米飯熟透為止。要求達(dá)到熟而不糊，外硬內(nèi)軟，內(nèi)無(wú)夾心，疏松易散，透而不爛，均勻一致。淋水降溫：用清潔冷水淋洗蒸熟的糯米飯，使其降溫至35℃左右，同時(shí)使飯粒松散。接入種曲釀制：將冷卻到35℃左右的米飯，按干糯米重量換算接種量，%的經(jīng)粉碎的根霉曲與米飯拌勻，盛于廣口培養(yǎng)瓶中，飯粒搭成中心下陷的喇叭形凹窩，以利于出汁，飯面均勻撒上少許曲粉，用封口膜及牛皮紙覆蓋于廣口培養(yǎng)瓶表面，用線包扎后置于30℃溫箱保溫培養(yǎng)48h即可食用。釀成的甜酒釀應(yīng)