【正文】 蛋白質相互作用的概述一、為什么要研究蛋白質相互作用二、蛋白質相互作用親和力：Kd=[A][B]/[AB] 三、蛋白質相互作用的應用 A、利用抗原和抗體的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色質沉淀，抗體篩庫 B、 利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin結合， C、直接利用蛋白質的相互作用：蛋白質親和層析，酵母雙雜交，phage display，Bait蛋白質篩表達庫，蛋白質組 四、相互作用的生物學意義：蛋白質間的相互作用是細胞生命活動的基礎。 五、生物學功能的研究：獲得功能或失去功能I、 一些常用蛋白質相互作用技術? Traditional copurification (chromatography copurification and cosedimentation)? Affinity chromatography：GST pull down ，Epitopetag? (co)Immunoprecipitation? Western和 FarWestern blotSurface Plasmon ResonanceTwoHybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)（實驗過程及原理，注意事項，優(yōu)缺點）III、研究實例討論一、酵母雙雜交系統(tǒng) 作用：發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質；鑒定和分析已有的蛋白質間的相互作用；確定蛋白質相互作用的功能基團具體過程：見書本優(yōu)點：是酵母細胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，簡單；弱的相互作用也能檢測到缺點：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用；酵母的翻譯后修飾不盡相同，尤其是蛋白質的調控性修飾；自身激活報告基因；基因庫德要求比較高，單向1/3是in frame蛋白質毒性；第三者Z插足介導的相互作用；假陽性酵母雙雜交系統(tǒng)是當前廣泛用于蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后，誘餌蛋白結合于報道基因的啟 動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列 化后則可用于大規(guī)模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。（1）原理：將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結合域BD的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個雜交體，當兩個雜交體共轉化酵母細胞（此酵母細胞上游有DNA結合位點的報告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨不能激活報告基因的轉錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個有效的轉錄激活子，激活報告基因的轉錄。因此可通過檢測報告基因的轉錄來研究蛋白質X和Y的相互作用。 (2)應用范圍1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質基因與BD基因構建成“誘餌”表達質粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構建成“獵物”基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cDNA序列，并推測其蛋白質序列。1） 二、噬茵體展示技術 在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白， 就會與相應抗體特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用于研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇 性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優(yōu)點。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細胞 系的cDNA文庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。 三、等離子共振技術 表面等離子共振技術(SurfacePlasmonResonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用 一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當待測蛋白與誘餌蛋白結合后，薄膜的共振性質會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優(yōu)點是 不需標記物或染料，反應過程可實時監(jiān)控。測定快速且安全，還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。 四、熒光能量轉移技術 （fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）FRET：優(yōu)點：體內測定兩個蛋白質之間的相互作用；敏感度高；溶解度好？；大分子的主要構象變化能測定；定量和定性測定相互作用。缺點：只能測定熒光基團大小為（20100?）的分子；儀器設備很貴；需要熒光標記 FRET可用于研究活細胞生理條件下研究蛋白質蛋白質間相互作用。 基本原理：在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于100 ?），就可觀察到熒光能量由供體向受體共振轉移的現(xiàn)象，即以前一種基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。其中以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)及其突變體的應用最為廣泛。 特點：a 反映在當時活細胞生理條件下蛋白質蛋白質間相互作用的動態(tài)變化過程。b 兩個熒光集團間的合適距離為20－100 ?（2－10nm）。c 需用熒光或GFP標記測試蛋白。熒光共振能量轉移（FRET）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用。與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、 DNA和RNA的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態(tài)性質。提出了一種定量測量 FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量 測量FRE