【正文】 蛋白質(zhì)相互作用的概述一、為什么要研究蛋白質(zhì)相互作用二、蛋白質(zhì)相互作用親和力：Kd=[A][B]/[AB] 三、蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用 A、利用抗原和抗體的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色質(zhì)沉淀，抗體篩庫 B、 利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin結(jié)合， C、直接利用蛋白質(zhì)的相互作用：蛋白質(zhì)親和層析，酵母雙雜交，phage display，Bait蛋白質(zhì)篩表達(dá)庫，蛋白質(zhì)組 四、相互作用的生物學(xué)意義：蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)。 五、生物學(xué)功能的研究：獲得功能或失去功能I、 一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)? Traditional copurification (chromatography copurification and cosedimentation)? Affinity chromatography：GST pull down ，Epitopetag? (co)Immunoprecipitation? Western和 FarWestern blotSurface Plasmon ResonanceTwoHybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)（實(shí)驗(yàn)過程及原理，注意事項(xiàng)，優(yōu)缺點(diǎn)）III、研究實(shí)例討論一、酵母雙雜交系統(tǒng) 作用：發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)；鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用；確定蛋白質(zhì)相互作用的功能基團(tuán)具體過程：見書本優(yōu)點(diǎn)：是酵母細(xì)胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，簡單；弱的相互作用也能檢測到缺點(diǎn)：都是融合蛋白，萬一融合出新的相互作用；酵母的翻譯后修飾不盡相同，尤其是蛋白質(zhì)的調(diào)控性修飾；自身激活報(bào)告基因；基因庫德要求比較高，單向1/3是in frame蛋白質(zhì)毒性；第三者Z插足介導(dǎo)的相互作用；假陽性酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟 動子，啟動報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，如果檢測到報(bào)道基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列 化后則可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。在實(shí)際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。（1）原理：將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。 (2)應(yīng)用范圍1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。1） 二、噬茵體展示技術(shù) 在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長時(shí)，表面就表達(dá)出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白， 就會與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，這被稱為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點(diǎn)，還具有直接得到基因、高選擇 性的篩選復(fù)雜混合物、在篩選過程中通過適當(dāng)改變條件可以直接評價(jià)相互結(jié)合的特異性等優(yōu)點(diǎn)。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細(xì)胞 系的cDNA文庫，并分離出了人上皮生長因子信號傳導(dǎo)途徑中的信號分子。 三、等離子共振技術(shù) 表面等離子共振技術(shù)(SurfacePlasmonResonance，SPR)已成為蛋白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用 一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白”，當(dāng)待測蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。SPR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是 不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過程可實(shí)時(shí)監(jiān)控。測定快速且安全，還可用于檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。 四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù) （fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）FRET：優(yōu)點(diǎn)：體內(nèi)測定兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用；敏感度高；溶解度好？；大分子的主要構(gòu)象變化能測定；定量和定性測定相互作用。缺點(diǎn)：只能測定熒光基團(tuán)大小為（20100?）的分子；儀器設(shè)備很貴；需要熒光標(biāo)記 FRET可用于研究活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間相互作用。 基本原理：在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)（一般小于100 ?），就可觀察到熒光能量由供體向受體共振轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團(tuán)的激發(fā)波長激發(fā)時(shí)，可觀察到后一個(gè)基團(tuán)發(fā)射的熒光。其中以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)及其突變體的應(yīng)用最為廣泛。 特點(diǎn)：a 反映在當(dāng)時(shí)活細(xì)胞生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間相互作用的動態(tài)變化過程。b 兩個(gè)熒光集團(tuán)間的合適距離為20－100 ?（2－10nm）。c 需用熒光或GFP標(biāo)記測試蛋白。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）廣泛用于研究分子間的距離及其相互作用。與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、 DNA和RNA的時(shí)空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET熒光顯微鏡有可能實(shí)時(shí)測量活體細(xì)胞內(nèi)分子的動態(tài)性質(zhì)。提出了一種定量測量 FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個(gè)比值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的串?dāng)_。該方法簡單快速，可實(shí)時(shí)定量 測量FRE