【正文】 2丙基戊酸和5氮雜胞苷對(duì)ips細(xì)胞誘導(dǎo)率影響的設(shè)計(jì)書第一部分 文獻(xiàn)綜述1．ips細(xì)胞發(fā)展簡(jiǎn)介 ips細(xì)胞的誘導(dǎo) iPS細(xì)胞的誕生成熟的體細(xì)胞由分化的狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)的過(guò)程稱之為細(xì)胞重編程，細(xì)胞重編程現(xiàn)象最早在核移植實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞重編程的方法包括體細(xì)胞核移植、miRNA干擾細(xì)胞質(zhì)重編程技術(shù)、多能干細(xì)胞和體細(xì)胞融合、多能細(xì)胞的提取物與體細(xì)胞共孵育等。其重編程過(guò)程包括染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙酰化、印記基因表達(dá)、端粒長(zhǎng)度恢復(fù)以及x染色體失活等。重編程后，體細(xì)胞核會(huì)忘卻原先體細(xì)胞留下的記憶重新進(jìn)人發(fā)育程序。Wilmut等H1及Cowan等都通過(guò)自己的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程成功。但是這些方法最大的缺點(diǎn)就是供卵缺乏、倫理道德及政府法規(guī)的限制等。因此科學(xué)家們努力尋求從法律、道德和倫理等方面更易被人們接受的體細(xì)胞核重編程的方法。細(xì)胞核移植和干細(xì)胞這兩個(gè)各自迷人的領(lǐng)域，在2006年發(fā)生了非常引人注目的碰撞。一些重大的發(fā)現(xiàn)為這次事件鋪平了道路。正如兩棲動(dòng)物中一樣，細(xì)胞核移植進(jìn)入小鼠卵母細(xì)胞后表明體細(xì)胞核重編程成為多能肽。2006年8月，通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中涉及細(xì)胞重編程的細(xì)胞因子的深入分析和研究，日本科學(xué)家Takahashi 和Yamanaka 研究小組將24 種轉(zhuǎn)錄因子排列組合導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，最終確定有4 種轉(zhuǎn)錄因子組合———OctSoxcMyc 和Klf4 即可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells )iPS細(xì)胞。它的誕生仿佛給沉寂一時(shí)的國(guó)際干細(xì)胞研究打入了一劑強(qiáng)心劑[1]。 通過(guò)外源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的誘導(dǎo)，使成體細(xì)胞重編程為胚胎干細(xì)胞 (ES 細(xì)胞) 樣的多能細(xì)胞，這種細(xì)胞稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPS 細(xì)胞)，這一方法被稱為iPS 技術(shù)。ips細(xì)胞除了不能生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細(xì)胞，如果用于醫(yī)療，那么理論上可以治愈所有疾病——凡是不好的組織都去除，替換為重新生長(zhǎng)的正常組織。它的功能幾乎可以和ES細(xì)胞相媲美。自從ES細(xì)胞涉及道德倫理的問(wèn)題以來(lái)，科學(xué)家用其來(lái)產(chǎn)生新生組織的想法就一直不能實(shí)施。而iPS以其突破倫理障礙的面貌改變大家對(duì)干細(xì)胞的看法，無(wú)疑，iPS是偉大的發(fā)現(xiàn)，它讓科學(xué)家們可以更深入地了解我們的細(xì)胞。也讓干細(xì)胞從理論研究到臨床應(yīng)用的步伐加快了許多，直接將病人的成體細(xì)胞改造成干細(xì)胞， 比再培育一個(gè)小孩取干細(xì)胞更符合倫理道德要求，也突破了移植排斥的障礙。ES細(xì)胞和ips細(xì)胞具有相同的基因。不同的是ES細(xì)胞中與細(xì)胞多能性有關(guān)的基因能夠表達(dá)，而這些因子就是OctSoxcMyc 和Klf4。已分化的細(xì)胞中這些基因不能表達(dá)。通過(guò)導(dǎo)入與多能性有關(guān)的外源基因來(lái)激活活體細(xì)胞中的多能性基因。從而使體細(xì)胞從分化狀態(tài)重編程為多能干細(xì)胞。試驗(yàn)中所用4種轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)過(guò)程中分別起不同作用：Oct4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子,維持細(xì)胞的多能性,是體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞所必須的基因。在小鼠和人的ES細(xì)胞中, Oct4表達(dá)的抑制將會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。Niwa等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Oct4能夠維持ES細(xì)胞未分化狀態(tài)并促進(jìn)其增殖,并認(rèn)為Oct4的活化是重編程為多能干細(xì)胞的標(biāo)志?！　ox2是胚胎干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,其與Oct4一樣均為體細(xì)胞重編程所必須的基因,除了可與Oct4協(xié)同調(diào)節(jié)維持細(xì)胞的多能性之外,還能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化。cMyc和Klf4不是iPS細(xì)胞形成所必須的基因,其作用是提高克隆形成的效率,當(dāng)同時(shí)將二者去除時(shí)iPS細(xì)胞將不能生成iPS細(xì)胞,因此cMyc和Klf4在iPS細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)程中同樣重要。cMyc是在人類癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的卟啉原癌基因,盡管cMyc可以提高iPS細(xì)胞克隆形成率,但其構(gòu)建的嵌合體小鼠約20%發(fā)生了腫瘤。所以如果將iPS細(xì)胞用于臨床治療, cMyc基因的轉(zhuǎn)入必須慎重。Klf4即是抑癌基因又是原癌基因,一方面可以促進(jìn)ES細(xì)胞的自我更新,另一方面在體細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)可抑制DNA的復(fù)制,阻滯細(xì)胞周期于G1/S期,因此它在細(xì)胞增殖和分化之間起開關(guān)作用[2]。iPS 技術(shù)雖然在不同物種的多種細(xì)胞上都取得了成功，但是不同的受體細(xì)胞、不同的細(xì)胞狀態(tài)及其傳代代數(shù)，對(duì)于誘導(dǎo)的效率，甚至誘導(dǎo)是否能取得成功都有一定的影響。因此，在實(shí)驗(yàn)之初需準(zhǔn)備符合要求的受體細(xì)胞。最初，研究者以胎鼠和成年小鼠的成纖維細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行iPS 誘導(dǎo)，雖然最終都得到了iPS細(xì)胞，但是采用胎兒細(xì)胞進(jìn)行的誘導(dǎo)效率明顯要高一些。這可能是由于胎兒細(xì)胞增殖活力強(qiáng)，并且甲基化程度較低，易于重編程。隨后，以小鼠肝臟細(xì)胞、胃表皮細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞，甚至成熟的B 淋巴細(xì)胞作為受體細(xì)胞進(jìn)行iPS誘導(dǎo)也都取得了成功，這充分說(shuō)明了iPS 技術(shù)的普遍適用性，也證明了各類體細(xì)胞都具有被重編程為多能性細(xì)胞的潛能。研究發(fā)現(xiàn)不同類型細(xì)胞來(lái)源的iPS 細(xì)胞具有不同的特點(diǎn)，如肝臟細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞來(lái)源的iPS 細(xì)胞其基因組不易被病毒整合，具有較低的致瘤性，更適合于醫(yī)學(xué)研究的需要。Aasen 等也發(fā)現(xiàn)以角質(zhì)細(xì)胞作為受體細(xì)胞可顯著提高iPS 的誘導(dǎo)效率，并能降低病毒在受體細(xì)胞基因組上的整合。另外，神經(jīng)干細(xì)胞本身表達(dá)較高的內(nèi)源性Sox2 等因子，當(dāng)采用Oct4 一個(gè)因子時(shí)，也能產(chǎn)生較高效率的iPS 細(xì)胞。因此，神經(jīng)干細(xì)胞可以作為理想的受體細(xì)胞。不同受體細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)效率的差異至今仍沒(méi)有確切的解釋，但是從iPS 誘導(dǎo)的過(guò)程可以認(rèn)為，這可能是由于不同受體細(xì)胞間的表觀遺傳修飾的差異引起的。不同細(xì)胞基因組的甲基化和乙?；潭雀鞑幌嗤?，誘導(dǎo)重編程過(guò)程中開啟外源基因表達(dá)的要求也不一樣，如誘導(dǎo)過(guò)程中添加甲基化酶抑制劑可以明顯提高誘導(dǎo)的效率。同時(shí)，有的受體細(xì)胞自身也表達(dá)部分的誘導(dǎo)因子，這不僅可以減少外源基因的使用數(shù)量，同時(shí)也減輕了重編程的負(fù)擔(dān)，進(jìn)而可以得到較高的iPS 誘導(dǎo)效率，且減少誘導(dǎo)的時(shí)間，例如神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS 細(xì)胞。由于取材和培養(yǎng)簡(jiǎn)便，原代成纖維細(xì)胞仍然是iPS 誘導(dǎo)中最常用的受體細(xì)胞。同時(shí)，為了確保受體細(xì)胞的增殖活力，盡可能使用低代數(shù) (3~5 代) 的原代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)[3]。 iPS 細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)得到的iPS 細(xì)胞以相應(yīng)物種的ES細(xì)胞為參照標(biāo)準(zhǔn)，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水平對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)。包括其多能性細(xì)胞特異的標(biāo)志基因的表達(dá)情況，向3 個(gè)胚層分化的潛能和自我更新能力，此外還涉及外源基因的沉默，及iPS 明確的遺傳背景。iPS 細(xì)胞中導(dǎo)入的外源基因表達(dá)水平要隨著重編程的完成逐漸降低或沉默，內(nèi)源的多能性基因表達(dá)激活，基因的選擇以ES 細(xì)胞表達(dá)的特異性標(biāo)志為參照。如通過(guò)RTPCR 檢測(cè)OctSoxNanog、RexSSEASSEASSEATra160、Tra181 等基因的表達(dá)情況且此類基因在不同物種間的表達(dá)不完全相同，如小鼠的iPS 一般