【正文】 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 第一節(jié) 酶的發(fā)酵生產(chǎn) 第二節(jié) 酶的純化 第三節(jié) 酶純度的評(píng)價(jià) 第四節(jié) 酶的劑型與保存 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 第一節(jié) 酶的發(fā)酵生產(chǎn) ? 一、產(chǎn)酶菌株的獲得 ? 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 一、產(chǎn)酶菌株的獲得 ? ? 用于發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需具備條件： ? ①酶產(chǎn)量高。通過各種育種。 ? ②容易培養(yǎng)和管理。培養(yǎng)條件易于實(shí)現(xiàn)和控制。 ? ③產(chǎn)酶穩(wěn)定性好。不易退化。 ? ④利于酶的分離純化。細(xì)胞及其他雜質(zhì)可分離。 ? ⑤安全可靠。使用的細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物安全無毒。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 產(chǎn)酶微生物 ⑴ 枯草芽 孢桿菌 應(yīng)用最廣的產(chǎn)酶微生物 。 α淀粉酶、 蛋白酶 、 β葡聚糖酶、堿性磷酸酶等。 ⑵ 大腸桿菌 一般都屬于胞內(nèi)酶。谷氨酸脫羧酶、用于 測(cè)定谷氨酸含量 ； β半乳糖苷酶，用于分解乳糖等。 ⑶ 黑曲霉 糖化酶、 α淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、 脂肪酶 、纖維素酶、橙皮苷酶、柚柑酶等。 ⑷ 米曲霉 糖化酶、蛋白酶釀酒；生產(chǎn) 氨基?；浮⒘姿岫ッ?、核酸酶 P果膠酶等。 ⑸ 青霉 產(chǎn)黃青霉用于生產(chǎn)葡聚糖氧化酶、果膠酶、纖維素酶 CX等；橘青霉用于生產(chǎn) 5′磷酸二酯酶 、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、 凝乳蛋白酶 等。 ⑹ 木霉 是生產(chǎn)纖維素酶的重要菌株。有纖維素 C1酶、 CX酶和纖維素二糖酶等。木霉中含有較強(qiáng)的 17 α羥化酶，用于甾體轉(zhuǎn)化。 ⑺ 根霉 糖化酶、 α淀粉酶、 轉(zhuǎn)化酶、 酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。 ⑻ 毛酶 蛋白酶、糖化酶、 α淀粉酶、 脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。 ⑼ 鏈霉菌 纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、 幾丁質(zhì)酶 等。 17 α羥化酶，用于甾體轉(zhuǎn)化。 ⑽ 啤酒酵母 啤酒、酒精、飲料酒和面包制作。生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、 丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶 等。 ⑾ 假絲酵母 脂肪酶、 尿酸酶、尿囊素酶、 轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。 17 α羥化酶，用于甾體轉(zhuǎn)化。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 一、產(chǎn)酶菌株的獲得 ? 2. 產(chǎn)酶菌株的選育 ? 微生物發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn) （ 1）種類多，并可根據(jù)需求篩選最佳的產(chǎn)酶菌株； （ 2）繁殖快，利于生產(chǎn)進(jìn)行； （ 3）培養(yǎng)易，生產(chǎn)成本經(jīng)濟(jì)； （ 4）可操控，連續(xù)化、自動(dòng)化降低生產(chǎn)成本； （ 5）能改良，微生物具有很強(qiáng)的適宜能力，可通過遺傳變異手段培育新的、更好的菌株，增加產(chǎn)品開發(fā)； 微生物 育種的方法 誘變育種 雜交育種 原生質(zhì)體融合 基因工程育種 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? 工藝流程 保藏細(xì)胞 固定化原生質(zhì)體 細(xì)胞活化 培養(yǎng)基 發(fā)酵 無菌空氣 預(yù)培養(yǎng) 原生質(zhì)體 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng) 固定化細(xì)胞 分離純化 酶 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? ? ⑴ 碳源 ? ⑵氮源 ? ⑶無機(jī)鹽 ? ⑷生長(zhǎng)因子 ? ⑸微量元素 ? 生產(chǎn)培養(yǎng)基與菌種培養(yǎng)基有很大區(qū)別。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 1）工業(yè)上常用的碳源 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 2）有機(jī)氮源 ? 來源： 工業(yè)上常用的有機(jī)氮源都是一些廉價(jià)的原料， 花生餅 ? 粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋 ? 白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、尿素、廢菌絲體和酒 ? 糟。 ? 成分復(fù)雜： 除提供氮源外，有些有機(jī)氮源還提供大量的無機(jī) ? 鹽及生長(zhǎng)因子。 ? 例 玉米漿： ①可溶性蛋白、生長(zhǎng)因子（生物素）、苯乙酸 ? ②較多的乳酸 ? ③硫、磷、等微量元素等 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 工業(yè)上常用的氮源及含氮量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） % 氮源 含氮量 氮源 含氮量 大麥 ~ 花生粉 甜菜 ~ 燕麥粉 ~ 甘蔗糖蜜 ~ 大豆粉 玉米漿 乳清粉 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 3）無機(jī)鹽 及微量元素 ? 大量元素： P、 S、 K、 Mg、 Ca、 Na、 Fe等。 ? （微生物生長(zhǎng)所需濃度在 103~104mol/L） ? 微量元素： Cu、 Zn、 Mn、 Mo、 Co等。 ? （微生物生長(zhǎng)所需濃度在 106~108mol/L） ? 一般微生物生長(zhǎng)所需要的無機(jī)鹽有：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鈉、鉀、鎂、鐵等金屬元素的化合物。 ? 以上物質(zhì)作為其生理活性物質(zhì)的組成和生理活性作用的調(diào)節(jié)物。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 （ 4）生長(zhǎng)因子 ? 從廣義上講，凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量的有機(jī)物質(zhì)，如 氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素 等均稱 生長(zhǎng)因子 。 ? 功能： 構(gòu)成細(xì)胞的組成分，促進(jìn)生命活動(dòng)的進(jìn)行。 ? 生長(zhǎng)因子不是所有微生物都必需的，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)缺陷 ? 型才是必不可少的。 ? 有機(jī)氮源是這些生長(zhǎng)因子的重要來源，多數(shù)有機(jī)氮源含有較多的 B族維生素和微量元素及一些微生物生長(zhǎng)不可缺少的生長(zhǎng)因子 . 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 B1 核黃素 B6 CoA 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? 斜面菌種培養(yǎng) 搖瓶或茄子瓶培養(yǎng) 一級(jí)種子的培養(yǎng) 二級(jí)種子的培養(yǎng) 發(fā)酵罐培養(yǎng) 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? ? ——pH調(diào)節(jié) ? 首先需要考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過程中的 pH值變化在合適的范圍內(nèi)。 ? （ 1）調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的 pH。 ? 基礎(chǔ)料中若含有玉米漿， pH呈酸性，必須調(diào)節(jié) pH。若要控制消后 pH在 ，消前 pH往往要調(diào)到 ~。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? （ 2）在基礎(chǔ)料中加入維持 pH的物質(zhì)。 ? 如代謝產(chǎn)酸物質(zhì)：葡萄糖（產(chǎn)酮酸）、（ NH4)2SO4 ? 代謝產(chǎn)堿物質(zhì)： NaNO尿素 ? 緩沖劑： CaCO磷酸緩沖液等 ? 生理酸、堿性物質(zhì)： ? (NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 ? NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? （ 3）、通過補(bǔ)料調(diào)節(jié) pH ? 在發(fā)酵過程中根據(jù)糖、氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料。在補(bǔ)料與調(diào) pH沒有矛盾時(shí)采用補(bǔ)料調(diào) pH ? 如 ①調(diào)節(jié)補(bǔ)糖速率；消泡劑 (如豆油 )的個(gè)別情況下， ? 還可采用提高空氣流量來加速脂肪酸的代謝，以 ? 調(diào)節(jié) pH ? ② 當(dāng) NH2N低， pH低時(shí)補(bǔ)氨水； ? 當(dāng) NH2N低， pH高時(shí)補(bǔ) (NH4)2SO4 ? ③ 當(dāng)補(bǔ)料與調(diào) pH發(fā)生矛盾時(shí)，加酸 ? 堿調(diào) pH 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 二、酶生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù) ? ? ——溫度調(diào)節(jié)控制 ? 溫度對(duì)發(fā)酵的影響 ? 影響微生物的生長(zhǎng) ? 影響各種酶的反應(yīng)速率 ? 改變菌體代謝的合成的方向 ? 影響發(fā)酵液的物理性質(zhì) 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溫度影響微生物的生長(zhǎng) 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溫度影響反應(yīng)速率 發(fā)酵過程的反應(yīng)速率實(shí)際是酶反應(yīng)速率，酶反應(yīng)有一個(gè)最適溫度。 阿累尼烏斯方程式 ( 1 )........RTEAek ??k反應(yīng)速度常數(shù)， 1/s ； A阿累尼烏斯常數(shù)， 1/s 。 R氣體常數(shù)（ ? mol)。 T熱力學(xué)溫度， K （ 0℃ =273K) 。 E活化能， J/mol 。 則：隨著溫度升高酶反應(yīng)速度增加 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溫度對(duì) 合成的方向 的影響 例：四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時(shí)能產(chǎn)生金 霉素。 ? 低于 30 ℃ ——合成金霉素能力較強(qiáng)。 ? 溫度提高 ——合成四環(huán)素的比例也提高。 ? 達(dá)到 35℃ ——?jiǎng)t只產(chǎn)生四環(huán)素而金霉素合成幾乎停止。 又如：赭曲霉 10 ℃ ——20 ℃ 發(fā)酵時(shí)，有利于合成青霉素 28 ℃ 時(shí)，則有利于合成赭曲霉素。 第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化 溫度對(duì)發(fā)酵液的物理性質(zhì)產(chǎn)生影響 影響發(fā)酵液的 ? 黏度 ? 氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速率 ? 某些基質(zhì)的分解速率 進(jìn)而影響發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特征和產(chǎn)物的生物