【正文】 基因表達(dá)系統(tǒng) 原核表達(dá)系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng) 藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng) 酵母表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 第五章 外源基因的表達(dá) 一、 大腸桿菌基因工程 二、酵母桿菌基因工程 三、哺乳動(dòng)物基因工程 四、高等植物基因工程 五、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 一、大腸桿菌基因工程 外源基因在 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策 利用重組 （一） ： 全基因組已測(cè)序，共有 4,405個(gè)開放閱讀框架，大部分基因生物學(xué)功能已鑒定； 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善； 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定； 被美國 FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。 ： 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，如糖基化、磷酸化； 缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能，表達(dá)產(chǎn)物多以無活性的包涵體形式存在； 內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定； 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素，痕量內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。 （二）外源基因在 強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成 抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)物降解 恢復(fù)蛋白質(zhì)特異性空間構(gòu)象 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成 啟動(dòng)子 (promoter, P) 啟動(dòng)子： 位于結(jié)構(gòu)基因上游 ， 能被 RNA聚合酶識(shí)別 、 結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA序列 ， 長 4060bp 。 因此， 是 。 沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。 RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子。 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游 35bp處 ， 由 10bp組成 ， 5’TGACA。 的核苷酸序列組成： 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游 510bp處 ， 由 68bp組成 ， 5’TATAAT， 富含 A和 T， 又稱 TATA盒 。 10區(qū)： 35區(qū)： 35區(qū) 與 RNA聚合酶 s亞基結(jié)合 10區(qū) 與 RNA聚合酶的核心酶結(jié)合 在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近 ， DNA被解旋成單鏈 ，RNA聚合酶 使第 1和 2個(gè)核苷酸形成磷酸二酯鍵， 并在其作用下向前推進(jìn) ， 形成新生 mRNA鏈 。 TGACA TATAAT 35區(qū) 10區(qū) +1位 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 開始轉(zhuǎn)錄 10區(qū) 和 35區(qū) 的堿基組成及其間隔序列 。 啟動(dòng)子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的 距離 。 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱取決于： 啟動(dòng)子是控制外源基因轉(zhuǎn)錄的重要元件 ，mRNA生成速率與其 強(qiáng)弱 密切相關(guān) 。 10和 35區(qū)與保守序列 （ 5’TATAAT、 5’T GACA） 相似度 越高 ， 啟動(dòng)子活性越強(qiáng) 。 10和 35區(qū)的間距越接近 17bp， 啟動(dòng)子活性越強(qiáng) 。 10區(qū)和 35區(qū)的堿基組成及其間隔序列： 大多數(shù) 點(diǎn)之間的距離是 69bp， 但對(duì)外源基因而言 ，這個(gè)距離范圍未必最佳 。 啟動(dòng)子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的距離： 1）啟動(dòng)子最佳距離的探測(cè) 目的基因 E E A E E 啟動(dòng)子 A酶切開 Bal31酶解 目的基因 將目的基因插在一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子下游 ，若克隆菌內(nèi)檢測(cè)不到 mRNA， 有必要考慮調(diào)整啟動(dòng)子與基因之間的距離 。 2）啟動(dòng)子的篩選： 探針質(zhì)粒 pKO1的 報(bào)告基因 ： 半乳糖激酶基因 galK 終止子 Ampr ori 無啟動(dòng)子 的 galK pKO1 kb 用同位素 32P標(biāo)記 ATP，測(cè)定從 ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖的32P的放射性強(qiáng)度 ， 可推算galK表達(dá)的半乳糖激酶的量， 由此比較啟動(dòng)子的強(qiáng)弱 。 3）啟動(dòng)子的構(gòu)建： 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 啟動(dòng)子 來 源 Plac Ptrp P?L PrecA Ptac T T T A C A T T G A C A T T G A C A T T G A T A T T G A C A T A T A A T T T A A C T G A T A C T T A T A A T T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 雙 Plac串聯(lián) = Plac 乳糖操作子 色氨酸操作子 ?噬菌體早期操作子 recA基因 Ptrp35區(qū) + Plac10區(qū) 4）啟動(dòng)子的可控性： 外源基因的全程高效表達(dá) ， 會(huì)對(duì) 生理生化 過程造成不利影響 。 外源基因持續(xù)高效表達(dá)的重組質(zhì)粒 ， 在細(xì)胞若干次分裂后 ， 會(huì)部分甚至全部丟失 ，導(dǎo)致重組菌 不穩(wěn)定 。 措施： 利用 可控性啟動(dòng)子 ， 調(diào)整外源基因的表達(dá)時(shí)序 ， 通過啟動(dòng)子活性的定時(shí)誘導(dǎo) ，將外源基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)限制在受體細(xì)胞生長的某一特定階段 。 目前廣泛應(yīng)用的 自相應(yīng)的操縱子 ， 都含有與 阻遏蛋白 特異性結(jié)合的操縱子序列 ， 其介導(dǎo)的外源基因在 基底水平 表達(dá) 。 乳糖啟動(dòng)子 Plac的可控性： 高效轉(zhuǎn)錄 乳糖 、 IPTG誘導(dǎo) Plac Olac 乳糖 、 IPTG可解除阻遏作用 ， 誘導(dǎo) Plac介導(dǎo)的目的基因表達(dá) 。 Plac Olac 野生型 Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起 。 基底水平轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 無誘導(dǎo)物存在時(shí) ， Plac受阻遏蛋白阻遏 ， 轉(zhuǎn)錄呈基底水平表達(dá) 。 色氨酸啟動(dòng)子 Ptrp的可控性： Ptrp Otrp Ptrp受 Trp阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏 ， 轉(zhuǎn)錄呈基底水平 。 基底水平轉(zhuǎn)錄 Trp 阻遏蛋白 高效轉(zhuǎn)錄 Otrp Ptrp 在操作上 ， 去除 Trp困難 ，往往通過 加入 IAA， 誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目的基因表達(dá) 。 除去 Trp 高效轉(zhuǎn)錄 Otrp Ptrp 或加入 IAA 在培養(yǎng)體系中 ， 去除 Trp或加入 3吲哚丙烯酸 (IAA)，可解除阻遏作用 。 ?噬菌體啟動(dòng)子 P?L的可控性： 升溫至 42℃ 時(shí) ， cI857失活脫落 ， 解除阻遏作用 ， P?L便可介導(dǎo)目的基因高效表達(dá) 。 高效表達(dá) P?L 目的基因 42℃ P?L 目的基因 基底水平表達(dá) cI857 P?L受溫度敏感的 cI857阻遏蛋白阻遏 ， 轉(zhuǎn)錄呈基底水平 。 在大型發(fā)酵罐中迅速升溫困難 ， 常使用 雙質(zhì)粒 控制系統(tǒng) ， 間接控制目的基因表達(dá) 。 cI857 Ptrp A IAA 去阻遏 B P?L 目的基因 阻遏作用 B 表達(dá) P?L Ptrp A Trp 目的基因 cI857 應(yīng)是誘導(dǎo)型的 ， 可通過簡單方式 、 使用廉價(jià)誘導(dǎo)物誘導(dǎo) ， 如溫度誘導(dǎo) 、 IPTG誘導(dǎo) 。 最佳啟動(dòng)子必須具備條件： 必須是強(qiáng)啟動(dòng)子 ， 能使外源基因表達(dá)量達(dá)細(xì)胞總蛋白的 1030%以上； 應(yīng)呈現(xiàn)低水平的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄； 終止子 (terminator, T) 強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性： 過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生會(huì)影響外源基因的表達(dá) 。 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子控制下表達(dá) ， 易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象 ， RNA聚合酶滑過終止子 ， 繼續(xù)轉(zhuǎn)錄鄰近序列 ， 形成長短不一的 mRNA混合物 。 過長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物影響外源基因表達(dá)的原因： 1） 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)