重組子的篩選與鑒定(已修改)
2025-05-26 05:18 本頁(yè)面
【正文】 第七章 重組子的篩選與鑒定 第一節(jié) 遺傳學(xué)檢測(cè)法 第二節(jié) 核酸分子雜交檢測(cè)法 第三節(jié) 電泳檢測(cè)法 第四節(jié) 免疫化學(xué)檢測(cè)法 第五節(jié) 核酸序列分析及其他方法 將目的 DNA片段與載體連接形成 重組子 ，然后通過(guò)各種方法將重組子導(dǎo)人宿主細(xì)胞。得到所需要的帶有重組DNA的轉(zhuǎn)化子是基因工程的目的所在。 轉(zhuǎn)化子 就是導(dǎo)入外源 DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。 在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，并非所有的細(xì)胞都轉(zhuǎn)入重組 DNA分子，即使所有的受體細(xì)胞都變?yōu)檗D(zhuǎn)化體，所獲得的轉(zhuǎn)化子仍是多種類(lèi)型的 DNA分子，因?yàn)樵谶B接產(chǎn)物中既有裁體和一個(gè)或數(shù)個(gè)串聯(lián)目的基因的連接，也有載體的自連，還有目的 DNA分子的自連，更多的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的 DNA片段。 因此在成千上萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)化子中，真正含有期望的重組 DNA分子的比例很少，為了將含有外源 DNA的宿主細(xì)胞和不含外源 DNA宿主細(xì)胞分開(kāi)，以及將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開(kāi)。這就需要設(shè)計(jì)出容易于篩選重組子克隆的方案并加以驗(yàn)證，這就是我們這一章要討論的內(nèi)容。 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定可以從不同的層次、利用不同的方法進(jìn)行?？偟膩?lái)說(shuō)，重組子的鑒定可以從 直接和間接 兩個(gè)方面分析，可以從 DNA、 RNA和蛋白質(zhì) 三個(gè)不同的水平進(jìn)行鑒定。 第一節(jié) 遺傳學(xué)檢測(cè)法 1 根據(jù)栽體表型特征的篩選 2 根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選 1 根據(jù)栽體表型特征的篩選 根據(jù)載體分子所提供的表型特征，選擇重組體DNA分子的遺傳選擇法，可適用于大量群體的篩選，因此是一種比較簡(jiǎn)單而又十分有效的方法。 含有一個(gè)選擇標(biāo)記 :實(shí)際操作中，最典型的方法是使用抗藥性標(biāo)記的插入失活作用，或是 β— 半乳糖苷酶基因的顯色反應(yīng)，將重組體 DNA分子的轉(zhuǎn)化子同非重組的載體轉(zhuǎn)化子區(qū)別開(kāi)來(lái)。 對(duì) λ噬菌體的置換型載體來(lái)說(shuō)。 λ噬菌體頭部外殼蛋白容納 DNA的能力是有一定限度的。其包裝能力應(yīng)控制在野生型 λDNA長(zhǎng)度的 75％一 105％之間 (36— 51kb)，這樣才能形成噬菌斑。因此， 包裝限制 這一特性，保證了體外重組所形成的有活性的 λ重組體分子，一般都應(yīng)帶有外源 DNA的插入片段， λ噬菌斑的形成本身就是對(duì) λ重組體的一種篩選特征。 在 PBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生隸抗性基因， Tetr上有插入位點(diǎn)BamH I和 Sal I。 Ampr上有插入位點(diǎn) Pst I。 四環(huán)素： 氨芐青霉素抗性基因： 產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，?碘 青霉素指示液 （ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。 殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。 環(huán)絲氨酸： 當(dāng)外源 DNA限制片段插入 pBR322質(zhì)粒的 BamH I和 Sal I位點(diǎn)時(shí)，抗四環(huán)素基因失活，重組體轉(zhuǎn)化子必定具有 Ampr Tets表型。將轉(zhuǎn)化菌先涂布在含有 Ampr的瓊脂平板上并將存活的 Ampr菌落原位影印到另一個(gè)含有 Tet的瓊脂平板上，凡是在 Ampr平板上生長(zhǎng)，而不在Tet平板亡生長(zhǎng)的菌落，就必定是已經(jīng)插入了外源 DNA限制片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆。 （ 1）四環(huán)素抗性插入失活 如果在 Tetr上插入外源 DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用 四環(huán)素加環(huán)絲氨酸 平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。 Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來(lái)； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。 （ 2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過(guò)程 如果 Ampr上插入外源 DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘 青霉素指示液選擇。 ?半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 . 原理：載體 上有一段 ?半乳糖苷酶基因（ Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源 DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組 中有突變的 ?半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。可以被 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以 互補(bǔ)形成完整有功能的 ?半乳糖苷酶。 ?半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì) 5溴4氯靛藍(lán)。 Xgal 半乳糖 5溴 4氯靛藍(lán) ?半乳糖苷酶 載體上 LacZ’的 5’端有一段多克隆位點(diǎn) (M
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