【正文】 第七章 電泳技術(shù) Electrophoresis 分析測試中心 劉蕓 1 內(nèi)容提綱 ? 紙電泳 ? 凝膠電泳 ? 等電聚焦電泳 ? 雙向電泳電泳技術(shù)（ DIGE） ? 毛細(xì)管技術(shù) 電泳技術(shù)概論 3 13 2 常用電泳技術(shù) 2 一、定義 電泳： 帶電粒子在直流電場中向著與其本身所帶電荷電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)： 生物樣品在電泳過程中因各組分的移動(dòng)快慢不同而被分離的技術(shù) 。 利用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。 第一節(jié) 電泳技術(shù)概論 3 4 二、電泳分析技術(shù)發(fā)展概況 1809年 發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象 1937年 Tiselius 自由界面電泳 1948年 Wieland 濾紙電泳 1959年 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1980’ s 毛細(xì)管電泳 (capiliary electrophoresis) Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 蒂塞利烏斯(瑞典人 )因研究電泳和吸附分析，特別是發(fā)現(xiàn)關(guān)于血清蛋白的復(fù)雜本質(zhì)而獲獎(jiǎng) 1948 5 三、電泳分析技術(shù)的分類 1. 根據(jù)被分離樣品的量多少 分析電泳 制備電泳 2. 根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳 100～ 500 V 高壓電泳 500～ 10kV 6 ① 濾紙及其他纖維薄膜電泳 ， 如醋酸纖維素 、 玻璃纖維 、 聚氯乙烯纖維 ② 凝膠電泳 ， 如瓊脂 、 瓊脂糖 、 硅膠 、 淀粉膠 、 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ③ 粉末電泳 ， 如纖維素粉 、 淀粉 、 玻璃粉電泳 ④ 絲狀電泳 ， 如尼龍絲 、 人造絲電泳 3. 根據(jù)電泳中是否使用支持物 自由電泳 — 不使用支持物，在溶液中進(jìn)行。 區(qū)帶電泳 — 使用支持物 (1) 按 支持物的物理性狀不同 ，可分為 7 (2) 按 支持物的裝置形式不同 ， 可分為 ① 平板式電泳 ② 垂直板式電泳 ③ 垂直柱式電泳 8 9 10 11 12 13 14 連續(xù) pH電泳 —指電泳過程中 pH保持不變 ， 如濾紙電泳 、 醋纖膜電泳 。 不連續(xù) pH電泳 —指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段有不同的 pH， 如 PAGE、 IFE。 優(yōu)點(diǎn)： 在不同 pH區(qū)之間形成高的電位梯度區(qū) ，使蛋白質(zhì)移動(dòng)加速壓縮為一極狹的區(qū)帶而達(dá)到濃縮的目的 。 4. 根據(jù)電泳系統(tǒng) pH是否連續(xù) ， 可分為 15 四、電泳技術(shù)的特點(diǎn) ? 凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分 離 ,并可進(jìn)行定性或定量分析 。 ? 樣品用量極少 。 ? 設(shè)備簡單 。 ? 可在常溫進(jìn)行 。 ? 操作簡便省時(shí) 。 ? 分辨率高 . 16 五、電泳技術(shù)應(yīng)用 ?臨床診斷 進(jìn)行血清蛋白、血紅蛋白、精蛋白、脂蛋白的分離、鑒定和含量測定以及血清學(xué)酶的檢驗(yàn)、免疫化學(xué)檢驗(yàn)等。 ?工業(yè)制造 用于提純酶、激素及其它生化產(chǎn)品 ?基礎(chǔ)理論研究 從分離與分析無機(jī)離子到復(fù)雜的生物高分子化合物，以及在放射化學(xué)和免疫化學(xué)中都占有重要的地位；在各類電泳技術(shù)中，尤以凝膠電泳在分離分析酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子等方面分辨力為最高，為生物化學(xué)，分子生物學(xué)的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)。 17 六、電泳的基本原理 懸浮或溶解在電解質(zhì)溶液中的帶電粒子，在電場作用下以不同的速度向著與自身所帶電荷極性相反的電極移動(dòng)。在電泳過程中，帶正電荷的粒子向電場的負(fù)極方向移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向電場的正極方向移動(dòng)。移動(dòng)的帶電粒子受到電場力和周圍介質(zhì)阻力的作用，當(dāng)二力平衡時(shí)，粒子以穩(wěn)定的速度向電極方向移動(dòng)。由于電荷、質(zhì)量等的差異，粒子將會(huì)有不同的質(zhì)/荷比，使其在電場中具有不同的遷移速度。 18 ? 以蛋白質(zhì)分子為例 : （ q： 有效電荷， E： 場強(qiáng)） F= Eq 電場力： F’=6?r?v （ F’： 摩擦阻力， v： 在介質(zhì)粘度 η中半徑為 r的顆粒的移動(dòng)速度） 阻力： 19 V q M = ——— = ———— E 6?r? E q v = ———— 6?r? Eq = 6?r?v F = F’ 遷移率 （ Mobility) ——帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。 20 七、影響電泳速度的因素 1. 電場強(qiáng)度 （ E） E↑→電流 ↑→熱效應(yīng) →支持介質(zhì)上的水分蒸發(fā) →樣品的熱變性 E↓→電泳速度慢 →延長電泳時(shí)間 →樣品擴(kuò)散 →區(qū)帶模糊不清 →分辨率下降 常壓電泳 100～ 500 V 1V/cm~10V/cm 高壓電泳 500～ 10kV 20V/cm~200V/cm 21 溶液的 I 越高 ， 質(zhì)點(diǎn)的泳動(dòng)速度越慢 ， 但區(qū)帶分離度卻較清晰 。 I↑→緩沖能力越大 →緩沖液所載的分電流增加 ， 而樣品所載的電流相應(yīng)減少 →電泳速度減慢 2. 離子強(qiáng)度 （ I） ?? 221iiZmI（ m： 離子的摩爾濃度， Z：離子的價(jià)數(shù)） 對于稀溶液： 22 pH值決定了化合物解離的程度 ， 也決定了物質(zhì)所帶的凈電荷 。 3. 緩沖液的 pH 23 氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)（ pI） pH = pI 凈電荷 =0 pH pI 凈電荷為正 pH pI 凈電荷為負(fù) NH2 CH R COOH NH3+ CH R COO CH R COO NH3+ + H+ + OH + H+ + OH (pK180。1) (pK180。2) 等電點(diǎn) (isoelctric point)： 當(dāng)氨基酸溶液在某一定 pH值時(shí) ， 使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等 ， 成為兩性離子 ， 在電場中既不向陽極也不向陰極移動(dòng) ， 此時(shí)溶液的 pH值 。 24 +++++++++ ————— ————— +++++++++（ 液 ） 負(fù)極 ← →正極 4. 電滲效應(yīng) 電滲（ electroosmosis） ——指在電場作用下液體相對于固體支持物的相對移動(dòng)。 25 5. 分子篩 在凝膠電泳中 ， 分離蛋白質(zhì)等物質(zhì)除了利用所帶電荷的差異的效應(yīng)外 ， 還利用了其分子量的不同及形狀不同 。 6. 溫度 電泳時(shí)電流通過支持介質(zhì)會(huì)產(chǎn)生熱量。 按焦耳定律，電流通過導(dǎo)體時(shí)的產(chǎn)熱與電流強(qiáng)度的平方、導(dǎo)體的電阻和通電的時(shí)間成正比（ Q=I2Rt） 26 第二節(jié) 常用電泳技術(shù) （一）紙電泳 濾紙電泳 （ paper electrophoresis） ——是指用濾紙作為支持載體的電泳方法。 濾紙水平地架設(shè)在支持板上。把樣品以帶狀加在作為支持體的濾紙內(nèi)來檢測其移動(dòng)和分離的方法。最初用于蛋白質(zhì)，后來也用于氨基酸、核苷酸一些低分子物質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)在于或采用濾紙與色素結(jié)合的直接電泳圖，或剪下濾紙的任何部分來抽提其中的物質(zhì)。 27 薄膜電泳 （衍生） 支持體： 薄膜 優(yōu)點(diǎn)： ； ； 3. 需加樣量少；4. 親水性小 應(yīng)用： 廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和同工酶等的分離分析 Magnification of Cellulose Acetate filter 28 支持物： 多孔凝膠。如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠等，具有電泳和分子篩的雙重作用，分辨力高。 （二）凝膠電泳 凝膠電泳 （ agarose gel electrophoresis） ——是指用凝膠物質(zhì)作為支持載體的電泳方法。 最常用 聚丙烯酰胺凝膠 和 瓊脂糖凝膠電泳 原因： 機(jī)械強(qiáng)度好，透明有彈性，穩(wěn)定，無吸附作用和電滲作用，可制成不同孔徑的凝膠。 分類： 垂直管型盤狀電泳、垂直板型電泳； 連續(xù)、不連續(xù)、梯度、 SDS凝膠電泳 32 33 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） 十二烷基硫酸鈉 聚丙稀酰胺凝膠電泳 不受蛋白質(zhì)原有電荷影響，主要取決于蛋白質(zhì)及其亞基分子量大小的方法，可對蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行分離，并可精確測得蛋白質(zhì)的分子量。 34 基本原理 SDS 即十二烷基硫酸鈉，是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵 。在 強(qiáng)還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇 的存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的 二硫鍵 被打開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質(zhì)分子與 SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物，復(fù)合物所帶的負(fù)電荷大大超過 了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） 35 SDSPAGE是一個(gè) 不連續(xù) 系統(tǒng)，由上層濃縮膠和下層的分離膠組成。 濃縮膠 （ pH6. 8， 孔徑大 ）主要作用是使樣品濃縮，使樣品在未進(jìn)入分離膠前，被濃縮成很窄的條帶，