【正文】 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 指導(dǎo)教師：任曉冬 單亞明 實(shí)驗(yàn)流程 土壤樣品中微生物的分離純化 細(xì)菌 酵母菌 霉菌 放線菌 形態(tài) 結(jié)構(gòu) 觀察 生理 生化 反應(yīng) nisin效價(jià) 測(cè)定 生長(zhǎng)曲線 測(cè)定 形態(tài)觀察 死活細(xì)胞鑒定 直接計(jì)數(shù) 測(cè)微技術(shù) 形態(tài) 結(jié)構(gòu) 觀察 培養(yǎng) 菌種保藏 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 相關(guān)理論知識(shí)（ 1） ?微生物的分離與純化 從混雜的微生物群體中獲得只含某一種或某一株微生物的過(guò)程 。 ?常用的分離 、 純化方法 微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落 ，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體 。 因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng) 。 獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成 。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 相關(guān)理論知識(shí)（ 2） ?土壤生境 土壤是微生物生活的大本營(yíng)，所含微生物無(wú)論數(shù)量還是種類都極其豐富 ,因此 ,土壤是微生物多樣性生長(zhǎng)的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 相關(guān)理論知識(shí)（ 3） ?乳酸菌 乳酸菌是一類能在碳水化合物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，在酸奶中大量存在。 ?乳酸菌形態(tài) 球形、類球狀、短桿或桿狀，有些細(xì)胞有芽孢。 ?代謝產(chǎn)物 以乳酸為主要代謝產(chǎn)物，有些乳酸菌可以產(chǎn)生乳鏈菌肽（ Nisin)，乳鏈菌肽有抑菌活性。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 目的要求 了解微生物分離和純化的原理 。 掌握常用的分離純化微生物的方法。 掌握倒平板的方法。 進(jìn)一步熟練和掌握微生物的無(wú)菌操技術(shù)。 掌握微生物的培養(yǎng)方法。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 實(shí)驗(yàn)原理（ 1） ?微生物分離與純化 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程。 ?平板分離法 普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件（如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等 ,或加入某種抑制劑），在平板上培養(yǎng)微生物，當(dāng)平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取，得到純種的微生物 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 實(shí)驗(yàn)原理（ 2） ?分離產(chǎn) Nisin的乳酸乳球菌時(shí)，要用選擇性平板 能夠產(chǎn)生 Nisin的乳酸菌，自身會(huì)有對(duì)一定濃度的 Nisin 的抗性，而很多其它的細(xì)菌不具有這種抗性。所以，在純化乳酸乳球菌時(shí)，要在平板中加入一定量的 Nisin,使得對(duì) Nisin沒(méi)有抗性的其它細(xì)菌被抑制，平板中的單菌落就有更大的可能性是我們需要的乳酸乳球菌 ?采用在平板中加入抑制劑的方法是微生物學(xué)常用的分離純化微生物的方法。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 試劑與器材 材料 含大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、根霉、青霉和放線菌的土壤樣品及酸奶樣品，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（斜面、液體、半固體）、馬丁氏培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基等 試劑 10%酚、 4%水瓊脂 器材 盛 9mL無(wú)菌水的試管、盛 90mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶、涂布器、無(wú)菌吸管、接種環(huán)，酒精燈、無(wú)菌培養(yǎng)皿、顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 ?牛肉膏 3g ?蛋白胨 10g ?NaCl 5g ?瓊脂 1520g ?用水定容至 1000ml ?pH ?用于分離細(xì)菌 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 查氏培養(yǎng)基 ?NaNO3 2g ?K2HPO4 1g ?KCl ?MgSO4 ?FeSO4 ?蔗糖 30g ?瓊脂 1520g ?用水定容至 1000ml ?用于分離霉菌 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 高氏一號(hào)培養(yǎng)基 ?可溶淀粉 20g ?KNO3 1g ?NaCl ?K2HPO4 ?MgSO4 ?FeSO4 ?瓊脂 1520g ?用水定容至 1000ml ?pH ?用于分離放線菌 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 馬丁氏培養(yǎng)基 ? 葡萄糖 10g ? 蛋白胨 5g ? K2HPO4 1g ? MgSO4 ? FeSO4 ? pH 自然 ? 用水定容至 800ml ? 用于分離酵母菌 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 M17培養(yǎng)基 ? 蛋白胨 10 g ? 酵母粉 5 g ? 抗壞血酸 g ? 牛肉膏 g ? MgSO4 7H2O g ? 磷酸氫二鈉 19 g ? % 溴甲酚紫 16ml ? 用水定容至 1000ml ? 乳鏈菌肽（ Nisin) 250ml Nisin/1000ml培養(yǎng)基（ Nisin單獨(dú)滅菌 ) ? 用于分離酸奶中的乳酸乳球菌 ? 從酸奶中分離乳酸乳球菌的操作與從土壤中分離細(xì)菌操作相同 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 實(shí)驗(yàn)步驟 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 倒平板 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 菌懸液的配制 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 菌液的稀釋 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 接 種 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 培 養(yǎng) 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 微生物的純種培養(yǎng) 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 注意事項(xiàng) 接種環(huán)要灼燒滅菌。接觸菌體前要冷卻。 接種后要在火焰上灼燒。 實(shí)驗(yàn)在潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作時(shí)菌體不 應(yīng)和火焰太過(guò)接近。 本實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)格地按照無(wú)菌操作進(jìn)行。 培養(yǎng)時(shí)要倒置培養(yǎng)，防止染菌。 取單菌落時(shí)不要碰到其它的菌落。 土壤中微生物的分離純化、培養(yǎng)觀察及保藏 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 相關(guān)理論知識(shí) ?細(xì)菌形態(tài) ? 群體的形態(tài) 細(xì)菌菌落大多表面光滑濕潤(rùn)，有光澤，一般菌落較小，質(zhì)地顏色均勻，同培養(yǎng)基結(jié)合不緊密。菌落特征與組成菌落的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況、排列方式、好氣性和運(yùn)動(dòng)性直接相關(guān)。 ? 個(gè)體的形態(tài) 主要分為球菌、桿菌、螺旋菌三大類，近年還發(fā)現(xiàn)星狀和四方形細(xì)菌等。細(xì)菌形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)生變化。 細(xì)菌個(gè)體微小，較透明，必須染色方可呈現(xiàn)。根據(jù)細(xì)菌個(gè)體形態(tài)觀察的不同要求，可將染色分為簡(jiǎn)單染色、鑒別染色、特殊染色三種類型。 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 目的要求 顯微鏡下觀察細(xì)菌個(gè)體的形態(tài)。 學(xué)習(xí)環(huán)境中微生物的檢查方法，并加深對(duì)微生物 分布廣泛性的認(rèn)識(shí)。 了解簡(jiǎn)單染色法的原理，并掌握其操作方法 學(xué)習(xí)并掌握微生物涂片、染色的基本技術(shù)和無(wú)菌 操作技術(shù)。 鞏固顯微鏡的油鏡的使用方法。 初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)。 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 簡(jiǎn)單染色法原理 簡(jiǎn)單染色是利用單一染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。細(xì)菌在中性、堿性或弱酸性溶液環(huán)境中通常帶負(fù)電荷，堿性染料（解離時(shí)分子的染色部分帶正電荷）如美蘭、結(jié)晶紫等易與細(xì)菌結(jié)合使其著色。 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 試劑與器材 材料 枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及乳酸乳球球菌 試劑 呂氏堿性美藍(lán)染液或草酸銨結(jié)晶紫染液 器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、雙層瓶（內(nèi) 裝香柏油及二甲苯）、擦鏡紙、生理鹽水等。 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)步驟 ?涂片 ?干燥：室溫自然干燥 ?固定：通過(guò)火焰 2－ 3次，細(xì)胞質(zhì)凝固 ?染色：滴加染液 ?沖洗：水洗至無(wú)色 ?干燥：自然，吹干，吸干 ?鏡檢 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 注意事項(xiàng) ?涂片時(shí)水滴不要太大，菌體最好涂成一個(gè)薄膜。要求涂布均勻。 ?室溫自然干燥。 ?固定時(shí) , 通過(guò)火焰 2－ 3次，不可以加熱過(guò)久。 ?染色時(shí) , 滴加染液覆蓋上菌體薄膜即可。 ?沖洗時(shí) , 水洗至無(wú)色，要注意水流要有一個(gè)角度，從載片的一端自然流到另一端，但是水流要通過(guò)染色過(guò)的菌體薄膜。水流不宜過(guò)大，防止將菌體沖走。 ?鏡檢時(shí)，油鏡與普通的物鏡要嚴(yán)格地按照操作規(guī)程執(zhí)行。 細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 細(xì)菌的革蘭氏染色 相關(guān)理論知識(shí) ?革蘭氏染色法 它是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師 Gram創(chuàng)立。 ?菌種鑒定的重要手段 革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性菌（ G+）和革蘭氏陰性菌（ G）兩大類，它是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。 細(xì)菌的革蘭氏染色 目的要求 初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法 步驟 。