【正文】 第一章　緒論? 生物技術(shù)—定義為“紅色生物技術(shù)”、“綠色生物技術(shù)”和“灰色生物技術(shù)”三類?！凹t色生物技術(shù)”是指生物制藥技術(shù),“綠色生物技術(shù)”是指農(nóng)業(yè)和食品生物技術(shù),而“灰色生物技術(shù)”是指工業(yè)、環(huán)保生物技術(shù)。 ? 食品生物技術(shù)現(xiàn)代食品生物技術(shù)的作用 ? 一 食品原料和食品微生物的改良，提高食品的營 養(yǎng)價(jià)值及加工性能；? 二 生產(chǎn)各種功能食品有效成份、新型食品添加 劑；? 三 可直接應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程的物質(zhì)轉(zhuǎn)化；? 四 工業(yè)化生產(chǎn)預(yù)定食品或食品功能成分。第二章基因工程4個(gè)問題：1. 什么是基因工程——基因工程的概念在體外通過人工剪、接，將不同來源的DNA分子組成一個(gè)雜合DNA分子(DNA分子重組體)，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。因?yàn)橥ㄟ^人工設(shè)計(jì),得到一定的設(shè)計(jì)方案，所以也稱分子克隆。基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)。2. 為什么能進(jìn)行基因工程——基因工程的原理和技術(shù)（涵蓋3大理論和3大技術(shù)準(zhǔn)備）四．基因工程3大理論，3大技術(shù)準(zhǔn)備：（一）理論上的3大發(fā)現(xiàn)：1. 20世紀(jì)40年代，Avery發(fā)現(xiàn)了生物遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是DNA。超越時(shí)代的科學(xué)成就往往不易被人們接受，Avery當(dāng)時(shí)并未贏得陣陣掌聲，他的論文事隔10年以后才公開發(fā)表。2. 20世紀(jì)50年代，Watsoncrick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，搞清楚了生物遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制。3. 20世紀(jì)60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式：DNA→RNA→Pr,破譯了全部遺傳密碼，43。1．“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明2．載體(“交通工具車子”)－將質(zhì)粒作為基因工程載體使用3．逆轉(zhuǎn)錄酶——3大步驟（DNA體外重組，重組DNA如何進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，基因工程后處理）4. 基因工程的應(yīng)用和前景（一）基因（gene） 基因從化學(xué)上來說，指的是一段DNA或RNA順序，該順序可以產(chǎn)生或影響某種表型（genotype，phenotype）；從遺傳學(xué)上來說，基因代表一個(gè)遺傳單位，一個(gè)功能單位，一個(gè)突變單位。（二）基因工程（genetic engineering） 基因工程 在體外通過人工剪、接，將不同來源的DNA分子 組成一個(gè)雜合DNA分子(DNA分子重組體)，然后 導(dǎo)入宿主細(xì)胞去復(fù)制擴(kuò)增或表達(dá)。 因?yàn)橥ㄟ^人工設(shè)計(jì),得到一定的設(shè)計(jì)方案，故稱為基因工程。 由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行，所以也稱分子克隆。 基因工程的基本特點(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)。 在這個(gè)過程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“縫紉針” 連接不同來源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起 3.“交通工具” 使用載體好比一輛車子 4.“乘客” 有用基因 （二） 技術(shù)上的3大發(fā)明： 1．“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶的發(fā)明 （1）20世紀(jì)40－60年代，科學(xué)家們就為基因工程設(shè)計(jì)了美好的藍(lán)圖，但是面對(duì)龐大的dsDNA（104，*1011公里）束手無策，無從下手把它切成單個(gè)基因片斷。 （2）當(dāng)時(shí)的酶學(xué)知識(shí)已有相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但是沒有一個(gè)已發(fā)現(xiàn)的酶能完成這樣的使命。 （3）1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血桿菌（Haemophilus inffuenzae）分離純化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁錮，迎來了改造生物的春天，為基因工程奠定了最為重要的技術(shù)基礎(chǔ)。 2．載體(“交通工具車子”)－基因工程技術(shù)誕生的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備 （1）有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個(gè)車子將重組DNA送到宿主細(xì)胞中去。 （2）1946年起，Lederberg就研究細(xì)菌性因子（F因子）.5060年代相繼發(fā)現(xiàn)了R因子（抗藥因子），CoE(大腸桿菌因子)等質(zhì)粒。 （3）然而，直到1973年Cohen才能將質(zhì)粒作為基因工程載體使用（至今一直是基因工程最重要最廣泛使用的載體）。這是基因工程的第二個(gè)技術(shù)準(zhǔn)備。 3．逆轉(zhuǎn)錄酶－1970年Baltimove和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)（生物學(xué)）中心法則，使真核基因的制備成為可能。（為什么） (1)真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。HGP2005年完成，1－3kb/基因，104，*1011公里。 （2）即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRNA，沒有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。 （3）經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA (plementory DNA)文庫要比基因組文庫小得多，所以篩選陽性克隆就方便得多。 有了這些理論核技術(shù)的武裝，基因工程的臨盆降生指日可待，Berg和Cohen兩位科學(xué)的“助產(chǎn)士”，把基因工程接到了人間。 第二節(jié) 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)常用的工具酶（tool enzymes）有： （resriction enzymes,restriction endonadease)定義，分類，命名 一類專門切割DNA的酶，它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識(shí)別順序的特殊DNA序列。并切割dsDNA。 限制酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的（400多種E/350M）。所有的限制酶可分成3類。 （1）Ⅰ、Ⅲ型，兼具限制與修飾活性，它們識(shí)別與切割順序不在一個(gè)地方，不產(chǎn)生特異性的DNA片段，與基因工程意義不大（有說Ⅲ型識(shí)別核苷酸切割的位點(diǎn)一致，但罕見）。 （2）Ⅱ型 基因工程說到的限制酶是Ⅱ型酶，具有此類酶的微生物限制－修飾系統(tǒng)分別由限制酶核甲基化酶來完成。Ⅱ型酶分子量小，僅需Mg2＋作為催化反應(yīng)的輔因子，識(shí)別與切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生特異的DNA片段。3. 命名（1973年Smith 原則、Ⅱ型酶）根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個(gè)字母。第一個(gè)字母大寫 該微生物屬名前的第一個(gè)字母第二、三個(gè)字母小寫 該微生物種名前的2個(gè)字母第四個(gè)字母大寫 有變種或品系的第一個(gè)字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限 制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列（DNA ligase, ligase)—功能、影響連接酶作用的因素、連接方法（一）功能：催化有互補(bǔ)順序的兩個(gè)dsDNA分子的粘性末端或平頭末端3′－OH、5′－P連接作用。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。 （二）來源－、MW. 68KD。 （三）催化反應(yīng)： （1）需要ATP、Mg2+作輔助因子； （2）對(duì)粘性末端催化活性大于平頭末端（酶量1：100）? 體外連接的幾種方式： 1. 用ＤＮＡ連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片斷 2. 用Ｔ４ＤＮＡ連接酶將平末端的DNA片斷連接； 3. 用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片斷 加上poly(A) poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ連接 酶連接。 4. 先在DNA片斷末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，形 成粘性末端后，再用ＤＮＡ連接酶連接 影響連接酶作用的因素 1. 反應(yīng)溫度： 連接缺口的溫度：37度 連接粘性末端的最佳溫度： 4～15度 ： 平末端DNA分子的連接反應(yīng)中，最適1～2個(gè)單位。 粘性末端DNA片斷之間的連接， ATP的用量10μmol1mmol/L之間 3. 提高外源片斷與載體的濃度的比值（10～20倍）粘性末端DAN片斷的連接 由于具粘性末端的載體易發(fā)生自連。 對(duì)載體的5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連。 而外源片斷的5’P能與載體的3’OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去5’P的鏈不能進(jìn)行連接，形成3’ OH 和5’ OH 的缺口。平末端DNA片斷的連接 1）. T4DNA連接酶 2）. 用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端加上同聚物尾 巴之后，再用DNA連接酶連接。銜接物連接法 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子DNA，約10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。 將銜接物分子與平末端DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。DNA接頭（adapter）連接法： 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。 粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì)DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端5’P，暴露出5’OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。(DNA polymerase, DNA pol) –定義把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。(BAP或CIP)該酶用于脫去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’P成為5’OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當(dāng)需要5’端同位素標(biāo)記或?yàn)榱吮苊釪NA片段自身連接（或環(huán)化）時(shí)可進(jìn)行脫磷酸反應(yīng)。 以1. 和2. 最為常用，最為重要。工具酶現(xiàn)已商品化。第三節(jié) 載體載體的概念：（目的基因——研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。，可以插入或克隆DNA片段統(tǒng)稱為vector。，是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA基因工程載體的3個(gè)特點(diǎn)（一）能獨(dú)立自主的復(fù)制 載體DNA分子中有一段不影響它們擴(kuò)增的非必需區(qū)域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被動(dòng)的跟著載體一起復(fù)制/擴(kuò)增，就像載體的正常成分一樣。 （二）能便利的加以檢測(cè) 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細(xì)胞放在含有該抗生素培養(yǎng)板上培養(yǎng)生長時(shí)，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細(xì)胞才能存活。 （三）都能容易進(jìn)入宿主細(xì)胞中去，也易從宿主細(xì)胞中分離純化出來。噬菌體載體λ噬菌體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 兩端帶有12堿基的單鏈粘性末端，進(jìn)入 大腸桿菌后環(huán)化，既可溶菌又可溶原生長。 基因組分為三個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)包括使噬菌體成熟的全部基 因；中間區(qū)不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入 此區(qū)；右側(cè)區(qū)包括所有的主要調(diào)控成分。 λ噬菌體基因組中只有60%是溶菌生長必需的，作為克 隆載體時(shí)，可插入9~23kb的外源DNA片段質(zhì)粒載體(1) 染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子(2)大小為1～200kb；(３)能獨(dú)立于染色體外進(jìn)行自我復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞中 可含10～200個(gè)拷貝。(4)分高拷貝數(shù)和低拷貝數(shù)質(zhì)粒或窄宿主范圍和廣宿 主范圍 (5)質(zhì)粒包含：復(fù)制起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因和限制性 核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)常用質(zhì)粒有：pBR32pUC19質(zhì)粒的不相容性：同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒不能同時(shí)穩(wěn)定地保持在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象 ／粘尾質(zhì)粒(cosmid)柯氏質(zhì)粒定義: 含有入噬菌體粘性末端的復(fù)合質(zhì)粒。 由入DNA c o s區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成. 在宿主細(xì)胞中可以作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)噬菌體的任何功能。含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記如Ampr基因或Tetr基因及自主復(fù)制成分，所以這種粘性質(zhì)粒可以在細(xì)菌中大量復(fù)制擴(kuò)增。當(dāng)體外重組的粘性質(zhì)粒分子包裝成噬菌體顆粒并感染大腸桿菌后，可按質(zhì)粒的方式進(jìn)行復(fù)制。②帶有噬菌體的粘性末端(cos區(qū))。這一粘性末端是體外包裝系統(tǒng)必不可少的成分，所以它可以像噬菌體一樣進(jìn)行體外包裝。③具有一個(gè)或多個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)。④其本身分子量小，可容納40kb左右的DNA片段。⑤由于非重組體粘性質(zhì)粒很小，不能在體外包裝，因而體外包裝的主要是重組體，有