【正文】 第三章 ： 法醫(yī)物證 DNA分析 的生化基礎(chǔ) 伍新堯 法醫(yī)物證檢驗(yàn)： 分析檢材中的“ 個人特征” ——“遺傳特征” (Geic Characters) ， 群體 /個體的關(guān)系 ——“遺傳多態(tài)性”的個人特征 遺傳標(biāo)記的分類 1. 蛋白質(zhì)類 ： 糖蛋白－ RBC表面抗原 WBC— HLA 血清蛋白型 同工酶型 結(jié)構(gòu)蛋白－外貌特征 2. 核酸類 ： DNA RNA(mRNA, miRNA) 多態(tài)性遺傳標(biāo)記 遺傳多態(tài)性的定義：遺傳特征在個體間存在的差異。 按基因座為單位，低頻等位基因的頻率 ??????。 遺傳多態(tài)性的分類和各自的特點(diǎn)； 不同遺傳多態(tài)性的檢測方法； 表型舉例 ? 膚色（黑色）－－顯性 ? 耳垂（有）－－－顯性 ? 斜視（中國人）－顯性 ? 直發(fā)（東方人）－顯性 ? 趾蹼－－－－－－顯性 ? 眼瞼下垂－－－－顯性 ? 多指－－－－－－顯性 ? 濕耳垢－－－－－顯性 檢驗(yàn)個體遺傳特征的相關(guān)技術(shù) 1. PCR 2. 雜交 (hybridization） 3. 酶切 (restriction endonuclease digestion) 4. 測序 (sequencing) 5. 標(biāo)記 (labeled) 6. 電泳 (electrophoresis) 7. 染色 (staining)或顯色 (display) 8. 基因重組 (DNA rebination) 9. 計(jì)算機(jī)搜索比對 生化與分子生物學(xué)基礎(chǔ) 1． 生物界中心法則 : DNA—?RNA—?Protein 2． 蛋白質(zhì)的特性 酶 、 同工酶 、 酶促反應(yīng) （ 酶與底物的特異性關(guān)系 ） 3． 核酸 (DNA, RNA)的基本特性： 堿基配對 ， 可以 變性 ?復(fù)性 Tm（ 變性一半的溫度 ） = 4(G+C)+2(A+T) ℃ （ melting temperature） (20bp 左右的核酸片段的 Tm值計(jì)算公式 ) 溶液離子強(qiáng)度 ， 變性劑 ， 單鏈吸附現(xiàn)象 。 4． 核酸 5‘端可以被標(biāo)記 ： 標(biāo)記物 (放射性、非放射性 )，標(biāo)記要點(diǎn)，顯示方法的差異。 5． 限制性核酸內(nèi)切酶 （識別特異性序列） 、 特點(diǎn)、意義。 6． 遺傳變異 的分子基礎(chǔ)：突變、重組、轉(zhuǎn)座子、 (精子或卵子 成熟 過程 )的交換重組 7． 基因工程技術(shù) ： 雜交 （要 探針）， 測序技術(shù)（要引物） ， 重組（ 加上調(diào)控序列， promoter,可構(gòu)成新的遺傳物質(zhì) ）， 8． DNAchip： DNA分子的固定技術(shù) 9．基因工程技術(shù)引起的 倫理學(xué)問題 。 DNA RNA 轉(zhuǎn)錄、剪接、重排 蛋白質(zhì) 翻譯 調(diào)控 反轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄 病毒 反義治療 抗生素 化療 放療 化療 放療 核酶 microRNA 復(fù)制 蛋白質(zhì)構(gòu)像的改變瘋牛?。ㄔ略? 中心法則 蛋白質(zhì)的特性 1. （毛發(fā)、精子、指甲等含胱氨酸量高，胱氨酸（ SS） 由兩個半胱氨酸脫氫（氧化）后形成 , 加入 b巰基乙醇 還原后變成半胱氨酸（ —SH），才易受蛋白酶分解。 2. 蛋白質(zhì)具有兩性性質(zhì)， 等電點(diǎn)（ pI） 偏酸的溶液中帶正電，反之帶負(fù)電；可以電泳分離； 3. 加熱、加入乙醇、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、重金屬離子或生物堿等試劑可以使其 變性 ；（酶的活性喪失） 4. 有 4級結(jié)構(gòu)， 可 以成 為抗原， 刺激產(chǎn)生抗體； 5. 酶（包括限制性核酸內(nèi)切酶）屬蛋白質(zhì) ，其催化功能依賴完整的酶蛋白功能域（ domain）， 底物有高度專一性 ，要求最適溫度和最適 pH， 有激活劑和抑制劑。 大多數(shù)酶在 40℃ 以上會失活。（ 保存條件嚴(yán)格：4℃ 以下，反復(fù)凍融使活性喪失 ）； Taq DNA 聚合酶例外。 堿基配對 限制性核酸內(nèi)切酶 （ Restriction endonuclease） 1. 單鏈多肽，最適 pH為 6～ 8， NaCl有抑制作用，被 Mg2+ 激活 ，巰基有保護(hù)作用，對熱不穩(wěn)定，于含 50％甘油的緩沖液－ 20℃ 保存； 2. 識別序列 多為回文結(jié)構(gòu)，水解磷酸二酯鍵，切端分平頭（鈍端）和突出（黏性）末端兩種 。 3. 回文 可以倒讀，舉例 ： 池蓮照曉月，幔錦拂朝風(fēng)。 風(fēng)朝拂錦幔，月曉照蓮池。 限制性核酸內(nèi)切酶舉例 （ DNA指紋檢測和 AmRFLP時用） 切出粘端 Hpa II 5?G ? CGC3? Bam H1 5? T?CCGGA3? Eco R1 5?G ? AATTC3? 切出鈍端（平端） Alu I 5?AG ? CT3? Sma I 5?CCC ? GGG3? 雜交及其條件 （ DNA指紋檢測和 HLA基因檢測用 ) 1. 堿基配對的原則， G/C比 A/T牢固（意義：退火溫度要高） 2. 變性 ?復(fù)性的條件 3. 單鏈 DNA的特性－吸附在硝酸纖維素膜 (nitrocellulose membrane)或尼龍膜 (nylon membrane)上 4. 雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性（溫度 +、離子強(qiáng)度 、洗滌次數(shù) +） DNA復(fù)制的條件 （細(xì)胞中 /試管中比對） 1. 單鏈 DNA模板－ （解鏈酶、 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶） 2. 引物的特異性－ 20 bases（ 細(xì)胞中引物酶合成 RNA引物） 3. DNA聚合酶 （細(xì)胞中的 DNA聚合酶 III） , 效率 2500bp/s 4. 原料－ dNTPs 5. 合適的溶液（ Mg2+） 6. DNA復(fù)制的方向： 5’ ???’ 檢測基因產(chǎn)物多態(tài)性的局限 1． 基因產(chǎn)物易受外界因素干擾 ， 不能持久 （ 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ，抗原決定族等易受破壞 ， 改變 ， 酶活性中心失活 ） 2. 技術(shù)上的先天不足 HLA的 Ab與 Ag各自都有廣泛的交叉反應(yīng) 。 使定型困難 ，或無法解釋 。 3. 遺傳變異 ABO血型遺傳變異 B+O→A 、 CisAB、 Oh 4. 基因表達(dá)過程中影響因素多 生理病理過程基因表達(dá)受時 ， 空 （ 組織特異性 ） 限制 。 5． 人的 3萬多個基因中只有 5%有活性 。 DNA 作為個人認(rèn)定的基本條件 （生化基礎(chǔ)） 1. 分別來自父親和母親 受精卵 DNA來自于精子和卵子 ； 個體的生長來源于受精卵的分裂 胚胎 分化成組織器官 成熟的個體。 細(xì)胞不斷分裂 ， DNA不斷自我復(fù)制：嚴(yán)格按照半保留 法則，保證個體全部有核細(xì)胞的 DNA組成與受精卵的 完全一致 。 2. 完全個體特異的 DNA序列包含了人的 全部遺傳信息 。世界上沒有 任何兩個個體（單卵雙生除外）的 DNA序列完全相同 。 DNA標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn) 1. 多態(tài)性高： DNA指紋 (DNA fingerprint)， 5000 ~2萬個 STR位點(diǎn) ，1個 SNP位點(diǎn) /1kb， MVRminsatellite。 單個 STR位點(diǎn)的等位基因數(shù)量多； 個體分辨率 (discriminating power)高 2. 沒有兩個人 (單卵雙生除外 )的 DNA序列是完全相同的 。 3. 干燥后可以長期保存 （ 9400 y） 。 4. 線粒體 DNA多拷貝 （ 幾個～ 1000個 ） ， 檢測靈敏度高 。 5. DNA分析技術(shù)成熟 ， 可機(jī)械化 、 自動化 . 二 . DNA分類及遺傳規(guī)律 1. 父母源性 : chromosomal DNA 2. 母源性： mitochondrial DNA(16569bp清楚 ) 3. 父源性： Ychromosomal DNA(現(xiàn)已有 超過 150個 STR位點(diǎn)具有多態(tài)性 ) DNA polymorphis