三、基因工程的基本條件-工具酶和細胞(已修改)
2025-02-02 22:06 本頁面
【正文】 Geic Engineering 3 基因工程的基本條件 C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞 B 用于 基因克隆的載體 A 用于核酸操作的工具酶 A 用于核酸操作的工具酶 3 基因工程的基本條件 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修飾酶 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能 識別雙鏈 DNA分子中的特定序列，并切割 DNA雙鏈 主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來 DNA的入侵 細菌的限制與修飾作用 hsd R： 編碼限制性核酸內(nèi)切酶 hsd M： 編碼限制性甲基化酶 hsd S： 編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達 1968年， Smith等人首先從 流感嗜血桿菌 d株中分離出 Hind II和 Hind III 限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的 外源 DNA切成小片斷。 （ 1）限制（ Restriction） 細菌自身的 DNA堿基被 甲基化酶 甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。 （ 2）修飾（ Modification） ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤 N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或 CCTGG序列在第二個 C上C5位置上引入甲基 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的類型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修飾 多功能 單功能 雙功能 蛋白結(jié)構(gòu) 異源三聚體 同源二聚體 異源二聚體 輔助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg2+ SAM Mg2+ 識別序列 TGAN8TGCT 旋轉(zhuǎn)對稱序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位點 距識別序列 1kb處 識別序列內(nèi)或附近 距識別序列下游 隨機性切割 特異性切割 2426bp處 首先由 M. Meselson和 R. Yuan在 1968年從大腸桿菌 B株 和 K株 分離的。 （ 1）識別位點序列 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK： AAC(N)6GTGC I型限制性內(nèi)切酶 如 EcoB和 EcoK。 未甲基化修飾的特異序列。 需 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷甲硫氨酸）。 （ 3）作用機理 在距離特異性識別位點約 1000— 1500 bp處 隨機 切開一條 單鏈 。 Recognize site cut （ 2）切割位點 首先由 . Smith和 . Wilcox在 1970年從流感嗜血菌中分離出來。 分離的第一個酶是 Hind Ⅱ П型限制性內(nèi)切酶 限制 修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩種不同酶分子組成 ,分子質(zhì)量小 ,能識別 DNA的特殊序列 ,種類多 ,在基因工程中起重要作用 . III類限制性內(nèi)切酶 在完全肯定的位點切割 DNA，但反應需要ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 在基因工程操作中用途不大。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 屬名 種名 株名 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌 d株 同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶 II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識別雙鏈 DNA分子中 4 8對堿基的特定序列 大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè) 識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型 回文結(jié)構(gòu) 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoR I的識別序列 EcoR I的切割位點 EcoRI等產(chǎn)生的 5‘粘性末端 5‘ … GCTGAATTCGAG … 3’ 3‘ … CGACTTAAGCTC … 5’ EcoRI 37 ℃ 5‘ … GCTGOH PAATTCGAG … 3’ 3‘ … CGACTTAAP OHGCTC … 5’ 退火 47 ℃ 5‘ … GCTG AATTCGAG … 3’ 3‘ … CGACTTAA GCTC … 5’ OH P OH P PstI等產(chǎn)生的 3‘粘性末端 5‘ … GCTCTGCAGGAG … 3’ 3‘ … CGAGACGTCCTC … 5’ PstI 37 ℃ 5‘ … GCTCTGCAOH PGGAG … 3’ 3‘ … CGAGP OHACGTCCTC … 5’ 退火 47 ℃ 5‘ … GCTCTGCA GGAG … 3’ 3‘ … CGAG ACGTCCTC … 5’ OH P OH P ①連接便利 粘性末端的意義 i）不同的 DNA雙鏈： 只要粘性末端堿基互補就可以連接。 ii）同一個 DNA分子內(nèi)連接： 通過兩個相同的粘性末端可以連接成 環(huán)形分子 。 這比連接兩個平齊末端容易的多。 ③ 補平成平齊末端 凸出的 3’端 可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如 AAA或 TTT等）造成人工粘性末端。 ② 5’末端標記 凸出的 5’末端 可用 DNA多核苷酸激酶進行32P標記。 粘性末端可以用 DNA聚合酶補平成平齊末端。 PvuII等產(chǎn)生的平頭末端 5‘ … GCTCAGCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTC … 5’ PvuII 37 ℃ 5‘ … GCTCAGOH PCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCP OHGACCTC … 5’ 識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 同裂酶（ Isoschizomers) ① 完全同裂酶： 識別位點和切點完全相同
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1