【正文】 1 第六章 微生物的生長與控制 微生物的生長繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映 生長繁殖情況可以作為研究各種生理、生化和遺傳等問題的重要指標(biāo) 生產(chǎn)實(shí)踐中的各種應(yīng)用、對致病微生物和霉腐微生物的防治與其生長繁殖和抑制密切相關(guān) 本章內(nèi)容 測定生長繁殖的方法 微生物的生長規(guī)律 影響微生物生長的主要因素 微生物培養(yǎng)法 有害微生物的控制 2 生長 —— 微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用 異化作用時(shí)，生命個(gè)體的重量和體積不斷增大的過程。 繁殖 —— 生命個(gè)體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。 發(fā)育 —— 從生長到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡單到復(fù)雜、 從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。 個(gè)體生長 —— 微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個(gè)體生長。 群體生長 —— 群體中個(gè)體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓?、體積、密度或濃度來衡量。 （由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長來反映個(gè)體生長的狀況） 個(gè)體生長 ?個(gè)體繁殖 ? 群體生長 群體生長 = 個(gè)體生長 + 個(gè)體繁殖 生長與繁殖的概念 3 第一節(jié) 微生物純培養(yǎng)分離及生長測定方法 4 一、 獲得純培養(yǎng)的方法 純培養(yǎng) (pure culture)—— 微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代 ,稱純培養(yǎng) . 5 首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋 ,目的是得到高度稀釋的效果 ,使一支試管中分配不到一個(gè)微生物 .如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長 ,那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個(gè)微生物個(gè)體繁殖而來的純培養(yǎng)物 . 這種方法適合于細(xì)胞較大的微生物 . ① 液體稀釋法 6 ② 平板劃線分離法（ Streak Plate） 特點(diǎn)：快速、方便。 分區(qū)劃線（適用于 濃度較大 的樣品） 連續(xù)劃線（適用于 濃度較小 的樣品） An inoculating loop is used to thin out anisms on the surface of the agar. 7 連續(xù)劃線 劃線分離后平板上顯示的菌落照片 8 ③ 傾注平板法（ Pour Plate） Organisms are serially diluted, then a small amount is added to an empty sterile petri dish, to which melted agar at 50 186。C is added. Then mix to distribute the anisms. 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9 ④ 平板涂布分離法（ Spread Plate） 簡單易行，但易造成機(jī)械損傷 Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod. 10 ⑤ 選擇性培養(yǎng)分離法 為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。 ＊利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離 ＊富集培養(yǎng) 11 ⑥單細(xì)胞（單孢子）分離法 采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。 毛細(xì)管法： 用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適合于較大微生物。 顯微操作儀： 用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。 小液滴法： 將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。 12 ⑦ Membrane Filter When there is a small number of anisms in a large amount of liquid, the liquid is filtered through a membrane and then the membrane is placed on agar in a petri dish. 13 微生物純培養(yǎng)分離方法的比較 分離方法 應(yīng)用范圍 平皿劃線法 方法簡便 ， 多用于分離細(xì)菌 稀釋倒平皿法 即可定性 ， 又可定量 ， 用途廣泛 單細(xì)胞挑取法 局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究 利用選擇培養(yǎng)基法 適用于分離某些生理類型較特殊的 14 二、微生物純培養(yǎng)生長的測定方法 描述不同種類、不同生長狀態(tài)的微生物生長情況，需選用不同的測定指標(biāo)。 （一）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測法 直接法 （血球計(jì)數(shù)板、比例計(jì)數(shù)法） 間接法 （活菌計(jì)數(shù)法、 液體稀釋法、膜過濾法 ） （二）微生物生長量和生理指標(biāo)測定法 直接法 (干重法，堆體積法 ) 間接法 （比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標(biāo)） 15 16 原理：將 1cm2 400小格，從中均勻分布地選取 80或 100小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。 適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?1）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（ 2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。 特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對酵母菌可同時(shí)測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。 17 應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適 于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。 方法：用鏡臺測微尺計(jì)算出視野面積；取 1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代 入公式： 每 ml原菌液含菌數(shù) = 視野中平均菌數(shù)涂布面積 / 視野面積 100 稀釋倍數(shù) 18 平板菌落計(jì)數(shù)法最 常用的活菌計(jì)數(shù)法。將適當(dāng)稀釋的菌液傾注平板或涂布在平板表面，經(jīng)保溫培養(yǎng)后，以平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以稀釋度就可以計(jì)算出原菌液的含菌量。直徑 9 cm 的培養(yǎng)皿平板上出現(xiàn)菌落數(shù)一般以 50~ 500 為宜。按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品菌落總數(shù)測定的計(jì)數(shù)原則，以平板菌落數(shù)在 30 ~ 300 之間為報(bào)告依據(jù)。9 ml 9 ml 9 ml 9 ml1 ml 1 ml 1 ml1 ml 1 m l 1 m l 1 m l 2 2 2 19 ★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（ 1520min完成操作），嚴(yán)格無菌操作； ★注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度； ★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物， ★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作 ★ A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony。 plate counts are reported as number of colonyforming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample. 20 液體稀釋法對 樣品做 10 倍連續(xù)稀釋，從適宜的 3 個(gè)連續(xù)稀釋度中各取 5 ml 試樣，接種 3 組共 9 支裝有培養(yǎng)液的試管中（每管接入 1 ml ）。 經(jīng)培養(yǎng)后，記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查 .N. 表（ m o s t probab le nu m ber ， 最大可能數(shù)），根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)就可計(jì)算處其中的活菌含量。9 m l 9 m l 9 m l 9 m l1 m l 1 m l 1m l 3 3 31 ml 1 ml 1 ml 1 ml10n 10n2 10n1 21 常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。 將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。 22 將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來 ,然后烘干 (干燥溫度可采用 105℃ 、 100℃或 80℃) 、稱重。一般干重為濕重的 10%— 20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約 1012— 1013g。 該法適合菌濃較高的樣品。 舉例：大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約 10–12~10–13g， 液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到 2 109個(gè) /ml時(shí) ， 100ml培養(yǎng)物可得 10~90mg干重的細(xì)胞 。 23 原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。 特點(diǎn)：快速、簡便；但易受干擾。 24 ?測含氮量 蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。 一般細(xì)菌含氮量為干重的 %，酵母菌為 %，霉菌為%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以 ，就可測得粗蛋白的含量。 ?其他方法 含碳、磷、 DNA、 RNA、 耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長量的測定。 25 Method Application Comments Direct microscopic count Enumeration of bacteria in milk or cellular vaccines Cannot distinguish living from nonliving cells Viable cell count (colony counts) Enumeration of bacteria in milk, foods, soil, water, laboratory cultures, etc. Very sensitive if plating conditions are optimal Turbidity measurement Estimations of large numbers of bacteria in clear liquid media and broths Fast and nondestructive, but cannot detect cell densities less than 107 cells per ml Measurement of total N or protein Measurement of total cell yield from very dense cultures only practical application is in the research laboratory Measurement of Biochemical activity . O2 uptake CO2 production, ATP production, etc. Microbiological assays Requires a fixed standard to relate chemical activity to cell mass and/or cell numbers Measurement of dry weight or wet weight of cells or volume of cells after centrifugation Measurement of total cell yield in cultures probably more sensitive than total N or total protein measurements Table 1. Some Methods used to measure bacterial growth 26 第二節(jié) 微生物的生長規(guī)律 27 由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長存在著技術(shù)上的困難。 ?同步生長 的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長（