【正文】 第 14章 原核生物基因的表達及其調控 生物體的每個活細胞都含有相同的一整套基因。 基因表達具有高度的時空專一化：如肌紅蛋白基因（肌細胞）。 基因表達的調控：生物有機體對其基因表達的時空程序、表達速率等所進行的調節(jié)和控制。 本底水平表達：調控處于關閉狀態(tài)，只翻譯極少量的蛋白質。 概 述 Thus the differential transcription of different genes largely determines the actions and properties of cells. 生命的一個基本現(xiàn)象 哪些基因被轉錄，轉錄的效率如何。 mRNA類型，mRNA數(shù)量。 蛋白質的類型，蛋白質的數(shù)量。 特定細胞的功能和屬性。 第一節(jié) 原核生物基因的轉錄和翻譯 原核生物的 DNA： 單個裸露的 DNA 不編碼占 5% 轉錄和翻譯同一時間、地點進行 轉錄水平調控為主 ，兼有翻譯水平調控 ? 根據(jù)基因表達產(chǎn)物可劃分： 組成型蛋白：基因表達不受時期、部位、環(huán)境 影響 —— 組成型表達。 調節(jié)型蛋白 /適應型蛋白：基因表達受時期、部位、環(huán)境影響 —— 非組成型表達。 ? 一種生物的整套遺傳密碼可以比作一本密碼字典 ,該種生物的每個細胞中都有這本字典 。 為什么基因只有在它應該發(fā)揮作用的細胞內和應該發(fā)揮作用的時間才能呈現(xiàn)活化狀態(tài) ? ? 結論：必然有一個基因調控系統(tǒng)在發(fā)揮作用 。 ? 基因調控主要在三個水平上進行 : ? ① . DNA水平 ? ② . 轉錄水平 ? ③ . 翻譯水平 ? 一、轉錄的起始 轉錄是原核生物基因表達的主要調控點，主要涉及兩個方面： RNA合成的酶系； RNA合成起始和終止信號，即 DNA分子上的特定序列。 通過 RNA聚合酶、轉錄因子和啟動子的相互作用實現(xiàn)轉錄調控，改變細胞的表型，從而實現(xiàn)細胞生理狀態(tài)和環(huán)境的變化。 ? （一） RNA聚合酶 (RNA polymerase)： ? 大腸桿的的 RNA聚合酶：由 5個亞基組成，即α2ββ’σ，有時還有 2個 ω 亞基。以 α2ββ’σ組成的酶稱全酶。 σ亞基與其他亞基結合較松弛，易從全酶上解離；其余部分 α2ββ’稱為核心酶 (core enzyme)。 ? 在大腸桿菌中還發(fā)現(xiàn)一種新的 σ因子， 稱為 σ’因子 ，因此將含有 σ亞基的全酶稱為全酶 I，含有 σ’亞基的稱為全酶 Ⅱ 。二者的不同在于：全酶 Ⅱ 可以利用雙鏈DNA為模板合成 po1y〔 A)。 ? σ亞基作用： 參與啟動子的識別和結合以及轉錄起始復合物的異構化。細胞內哪條 DNA鏈被轉錄、轉錄方向與轉錄起點的選擇都與 σ亞基有關。 ? 離體實驗表明： 全酶所轉錄的 RNA和細胞內所轉錄出的 RNA，其起始點相同，序列相同，若僅用核心酶進行轉錄，則模扳鏈和起始點的選擇都有很大的隨意性，而且往往同一段 DNA的兩條鏈都被轉錄。 ? 由此可見： σ亞基對識別 DNA鏈上的轉錄信號是不可缺少的，它是核心酶和啟動子之間的橋梁。 σ因子的取代在細胞發(fā)育和對環(huán)境應答的反應中起主導作用。如在枯草桿菌中就有不同相對分子質量的 σ因子 (P227表 9— 1) ? 核心酶的 β亞基作用： 對 RNA聚合酶的功能至關重要，參與 RNA合成、終止信號的識別。由于 β亞基與 RNA的前體核昔三磷酸具有很高親和力，推測它可能參與底物的結合，以及催化磷酸二酯鍵的形成。 ? β’亞基作用： 可使聚合酶結合到模板 DNA上。 ? α亞基作用： 游離狀態(tài)，常以二聚體的形式存在，參與全酶同啟動子的牢固結合。 RNA聚合酶體積很大，橫跨近 60個堿基，而解旋的 DNA區(qū)域可能不到 17個堿基。當聚合酶按 5′→3′ 方向延伸 RNA鏈時，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動?？拷?3′端的 DNA不斷解旋。同時在 5′端重新形成 DNA雙鏈，不斷將 RNADNA雜合鏈中的 RNA鏈擠出。 ? （二）啟動子 (promoter)： ? 轉錄的起始是基因表達的關鍵階段，啟動子就是連接在基因 3’端上游的 DNA序列，其長度從 100 bp到 200 bp不等，是轉錄起始時 RNA聚合酶識別、結合的特定部位，但其本身并不被轉錄。 ? 在啟動子與終止子之間是一個轉錄單位，通常將mRNA開始的一個核苷酸定為 o點 (即 +1)。由此向右常稱為下游 (downstream)，其核苷酸依次編為正序號；起始點左例稱為上游 (upstream)，其核苷酸則依次以負號表示，緊接起始點左側的核苷酸為 1。 原核生物啟動子結構含有同源序列。整個啟動子包括兩個部分：其上游部分是CAPcAMP結合位點，下游部分是 RNA聚合酶的進入位點。（ P228229） Catabolite gene activation protein,CAP,代謝分解物基因激活蛋白 ? 二、轉錄的終止 ? （一）終止子及其結構： ? 概念： DNA上提供轉錄停止信號的一段序列稱為終止子 (terminator)，是一個基因的末端或是一個操縱子的末端的一段特定序列。 ? 類型：強終止子和弱終止子 ? 強終止子： 不依賴于 Rho蛋白質輔助因子而能實現(xiàn)終止作用，這類終止子屬于強終止子； ? 弱終止子： 依賴于 Rho蛋白糖助因子才能實現(xiàn)終止作用，這類終止子屬于弱終止子。蛋白質輔助因子稱為釋放因子，通常稱為 ρ因子。 ? 所有原核生物的終止子共同的序列特征： 即在轉錄終止點之前有一段回文結構，因而所產(chǎn)生的 mRNA可形成莖環(huán)狀的發(fā)夾結構，它可使 RNA聚合酶的移動停止或減緩。回文結構中富含 GC對，在回文序列的下游常有 6— 8個 AU對，因此這段終止子轉錄后形成的 RNA具有與 A相對應的寡聚 U，是使 RNA聚合酶脫離模板的信號。 ? 依賴子 ρ因子的終止子 其回文序列中 GC對含量較少，回文序列下方?jīng)]有固定結構，其 AU對含量也較低，因而是弱終止子，必需有 ρ因子存在時才發(fā)生終止作用；這也就是說依賴于 ρ因子的終止子由于其莖環(huán)結構常較短，在沒有 ρ因子時這種莖環(huán)結構不穩(wěn)定。即如果沒有 ρ因子存在． RNA聚合酶會繼續(xù)轉錄下去，這就稱為通讀(read through)，當 ρ因子存在時，轉錄才能終止。 ? ? 在強終止子中 ，由于其 DNA模板上富含 GC而使轉錄出的 RNA上富含 C和 G，于是 RNA與模板之間可以形成較強的氫鍵，成為 DNA— RNA雜合分子，從而阻礙 DNA聚合酶的前進而有利于終止。 ? （二） ρ因子輔助終止作用的機理 ? (三 )基因表達的極性現(xiàn)象 ? 在正常情況下原核基因表達時，其轉錄出來的mRNA隨即進行翻譯，這時整個 mRNA都覆蓋著核糖體， ρ因子無法接近 mRNA．而 RNA聚合酶早已越過前面的基因的依賴 ρ因子的終止子，所以轉錄實際上并不停止．而是繼續(xù)轉錄后續(xù)基因。如果在某一基因的依賴于 ρ的終止子之前發(fā)生無義突變，核糖體便從無義密碼子上解離下來，翻譯停止，核糖體不再進入到 mRNA上無義密碼子以后的位置上。于是 ρ就可以自由進入 RNA并移動，直到趕上停留在終止子上的RNA聚合酶。結果使 RNA聚合酶釋放，不能再轉錄下游基因。 ? 概念：基因表達的極性現(xiàn)象： 在某些情況下同一轉錄單位里，由于一個基因的無義突變，阻礙了其后續(xù)基因表達的效應．就稱為基因表達的極性現(xiàn)象。 ? 除了無義突變可以導致極性現(xiàn)象外，插入序列 ISIS2等 DNA片段插入到操縱子的基因中也會發(fā)生極性現(xiàn)象。 ? ρ因子也可發(fā)生突變，其效應的基本性質是使終止作用出現(xiàn)故障。突變常可抑制極性效應，這是因為其突變很可能減弱了 ρ對無義密碼子后面的中間終止子的作用，這樣翻譯的終止并不會使轉錄也停頓，且遠離無義突變的 DNA區(qū)段還可以被重新覆蓋的核糖體繼續(xù)翻譯 ? (四 )抗終止作用 ? ρ因子的作用可以被抗終止因子所抵消，這樣，RNA聚合酶便可通過終止子 (依賴于 ρ因子的 )繼續(xù)轉錄后面的基因。這種現(xiàn)象稱為抗終止作用(anti一 termination)。 ? 抗終止作用最有代表性的例子見于 λ噬菌體的時序控制。 λ噬菌體基因在裂解過程中的表達分前早期、晚早期和晚期 3個階段進行，其早期基因與晚期基因以終止子相隔。 λ噬菌體侵入敏感細胞，首先借助宿主的 RNA聚合酶轉錄前早期基因，由此獲得的表達產(chǎn)物N蛋白是一種抗終止因子，它與 RNA聚合酶作用使后者越過左右兩個終止子繼續(xù)轉錄，實現(xiàn)晚早期基因表達。 ? 三、原核生物 RNA的加工 (P233235) ? 四、 SD序列與翻譯效率 ? 核糖體結合保護降解法：測定 mRNA 上核糖體起始蛋白質合成的部位。在抑制多肽鏈伸長的條件下，當翻譯起始時，核糖體與 mRNA的結合位點已形成穩(wěn)定的復合體，于是加入核酸酶使未與核糖體結合的 mRNA的區(qū)段降解，而有核糖體結合區(qū)域則受到保護。 ? 在細菌中受核糖體保護的起始序列約 35～ 40個堿基長，其中包含起始密碼子 AUG。在起始密碼子上游約 4～7個核苷酸之前還有一段富含嘌吟的5′… AGGAGG… 3′短小序列，它可以與 16S rRNA3′端的 3′… UCCUCC… 5′區(qū)段完全互補。 mRNA上的這段序列稱為 Shine Dalgarno 序列（簡稱 SD序列）。 SD序列與 16S rRNA序列互補的程度以及從起始密碼子 AUG到嘌呤片段的距離也都強烈地影響翻譯起始的效率。不同基因的 mRNA有不同的 SD序列，它們與 16S rRNA的結合能力也不同，從而控制著單位時間內翻譯過程中起始復合物形成的數(shù)目，最終控制著翻譯的速度。 第二節(jié) 大腸桿菌乳糖操縱子的正負調控 ? 一、操縱子與操縱子模型 ? 操縱子學說 /操縱子模型： 、 （ 1960） lac operon( 1965諾貝爾醫(yī)學生理學獎 ) ? 操縱子：核酸分子上調控基因轉錄活性的基本單元，由結構基因、操作子（ O）和啟動子（ P）組成。 轉錄、翻譯、合成蛋白 結合調節(jié)蛋白 結合 RNA聚合酶 promoter structural genes operator 啟動基因 操縱基因 結構基因 操縱子 (operon)模型 調控（節(jié)）蛋白 操縱子 RNA R P O structural genes DNA Protein ＋ 正調控（ positive regulation) － 負調控 (negative regulation) 調控蛋白的作用機制 注： R： Regulator P： Promoter O： Operator 正調控系統(tǒng)中的正調控蛋白又被稱為無輔基誘導蛋白（ apoinducer) 負調控系統(tǒng)中的負調控蛋白又被稱為阻遏蛋白（ repressor) ? 二、正調控與負調控 ? 調節(jié)基因 RNA 調節(jié)蛋白 正調節(jié)蛋白 +操作子 結構基因轉錄、表達 基因失活，結構基因不表達 （正控制 /正調節(jié) ） 負調節(jié)蛋白 +操作子 結構基因轉錄、表達 基因失活，結構基因組成型表達 （負控制 /負調節(jié) ） 根據(jù)調節(jié)蛋白基因突變失活所產(chǎn)生的后果，可分： 隱性的組成型表達 —— 負控制系統(tǒng) 結構基因處于不可誘導狀態(tài) —— 正控制系統(tǒng) 根據(jù)輔因子（小分子）結合后調控效果，可分： 開啟調控系統(tǒng)中結構基因的轉錄活性 —— 誘導 關閉調控系統(tǒng)中結構基因的轉錄活性 —— 阻遏 操縱子調控系統(tǒng)的基本類型 ?可誘導負控制系統(tǒng) ?可誘導正控制系統(tǒng) ?可阻遏負控制系統(tǒng) ?可阻遏正控制系統(tǒng) ? 正調控與負調控并非互相排斥的兩種機制，而是生物體適應環(huán)境的需要，有的系統(tǒng)既有正調控又有負調控； 原核生物以負調控為主，真核生物以正調控為主； 降解代謝途徑中既有正調控又有負調控；合成代