【正文】 序列分析 一、堿基組成 DNA序列一個顯而易見的特征是四種堿基類型的分布。盡管四種堿基的頻率相等時對數(shù)學(xué)模型的建立可能是方便的，但幾乎所有的研究都證明堿基是以不同頻率分布的。 表 1包含了 9個完整 DNA分子序列的資料，表 2的數(shù)據(jù)來自兩個胎兒球蛋白基因 (Gr和 Ar)，每個基因具有三個外顯子和兩個內(nèi)含子 (shen等 1981)。這兩個例子說明序列內(nèi)和序列間堿基具有不同的頻率。在基因每一側(cè)的 500 個任意堿基區(qū)域被稱為“側(cè)翼”，基因間區(qū)域是指兩個基因間的其余序列。 表 1 九種完整 DNA序列的堿基組成 表 2 人類胎兒球蛋白基因不同區(qū)段的堿基組成 二．堿基相鄰頻率 分析 DNA序列的主要困難之一是堿基相鄰的頻率不是獨立的。堿基相鄰的頻率一般不等于單個堿基頻率的乘積 例： 雞血紅蛋白 β鏈的 mRNA編碼區(qū)的 438個堿基 圖 1 雞 β球蛋白基因編碼區(qū)的 DNA序列 (GenBank： CHKHBBM，記錄號 J00860) 表 3 圖 1雞 β球蛋白基因序列的相鄰堿基分布 在編碼區(qū)，存在某種約束來限制 DNA序列編碼氨基酸。在密碼子水平上，這一約束與堿基相鄰頻率有關(guān)。 表 4列出了遺傳密碼和圖 1序列中各密碼子數(shù)量。盡管數(shù)目很小，難以作出有力的統(tǒng)計結(jié)論，但編碼同一氨基酸的不同密碼子 (同義密碼子 )好像不是等同存在的。這種密碼子偏倚必定與兩堿基相鄰頻率水平有關(guān)。 表 4還清楚地表明，由于密碼子第 3位置上堿基的改變常常不會改變氨基酸的類型，因而對第 3位置上堿基的約束要比第 2位堿基小得多。 表 4 64種可能的堿基三聯(lián)體密碼子及相應(yīng)的氨基酸數(shù)（據(jù)圖 1序列） 相鄰堿基之間的關(guān)聯(lián)將導(dǎo)致更遠(yuǎn)堿基之間的關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)延伸距離的估計可以從馬爾科夫鏈 (Markov chain)理論得到 (Javare和 Giddings， 1989) 三．同向重復(fù)序列分析 除了分析整個序列堿基關(guān)聯(lián)程度的特征外，我們常對尋找同向重復(fù)序列 (direct repeats)之類的問題感興趣。 Karlin等(1983)給出了完成這一分析的有效算法。該法采用由特定的幾組堿基字母組成的不同亞序列或稱為字碼 (word)。只需要對整個序列搜索一次。給一堿基賦以值 α,例如 A、 C、 G、 T的值為0、 3。由 X X … 、 Xk 共 k個字母組成的每一種不同的字碼按： 計算字碼值。這些值的取值范圍為 1到 4k 例如： 5字碼 TGACC的值為1+3 44+2 43+0 42+1 41+1 40=459?？上葟牡?k值的字碼開始搜索。記錄序列中每一個位置 k字碼的字碼值。只有在發(fā)現(xiàn) k字碼長度重復(fù)的那些位置考慮進(jìn)行長度大于 k的字碼搜索。 序列 TGGAAATAAAACGTAAGTAG中所有堿基 2字碼 (k=2)的初始位置和字碼值。對于完全重復(fù)、長度大于 2的同向重復(fù)或亞序列的搜索可只限于 2字碼重復(fù)的初始位置。 在本例中只有 4個重復(fù)的 2堿基重復(fù)序列。例如，在位置 10和 15均發(fā)現(xiàn)了字碼值為 1的堿基重復(fù)序列。 從有重復(fù)的 2堿基為起點的 3字碼值中發(fā)現(xiàn)字碼值為 45和 49的序列有重復(fù)；以每一重復(fù)的 3堿基為起點的 4字碼搜索未能發(fā)現(xiàn)更長的重復(fù)序列。 表 5 序列 TGGAAATAAAACGTAAGTAG的 3字碼值和位置 (Karlin, 1983) 四、 RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 盡管現(xiàn)有一些 RNA折疊程序可以預(yù)測 RNA二級結(jié)構(gòu)，但這類分析仍然是一門藝術(shù)。 RNA折疊有助于找出 RNA分子中可能的穩(wěn)定莖區(qū)，但對給定的 RNA分子來說，這一結(jié)果的 生物學(xué)意義 究竟有多大，還是一個未知數(shù)。即使有此局限性，二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測還是有助于找出 mRNA控制區(qū)以及 RNA分子中可能形成穩(wěn)定折疊結(jié)構(gòu)的區(qū)段。 五、從序列中尋找基因 基因按其功能可分為 結(jié)構(gòu)基因 和 調(diào)控基因 ：結(jié)構(gòu)基因可被轉(zhuǎn)錄形成 mRNA，并進(jìn)而轉(zhuǎn)譯成多肽鏈；調(diào)控基因是指某些可調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。在 DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼子為止的一個連續(xù)編碼序列稱為一個開放閱讀框 (Open Reading Frame,ORF)。結(jié)構(gòu)基因多含有插入序列，除了細(xì)菌和病毒的 DNA中 ORF是連續(xù)的，包括人類在內(nèi)的真核生物的大部分結(jié)構(gòu)基因為斷裂基因，即其編碼序列在 DNA分子上是不連續(xù)的，或被插入序列隔開。斷裂基因被轉(zhuǎn)錄成前體mRNA，經(jīng)過剪切過程，切除其中非編碼序列 (即內(nèi)含子 )，再將編碼序列 (即外顯子 )連接形成成熟 mRNA，并翻譯成蛋白質(zhì)。假基因是與功能性基因密切相關(guān)的 DNA序列，但由于缺失、插入和無義突變失去閱讀框而不能編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。 一種典型的真核蛋白質(zhì)編碼基因的結(jié)構(gòu)示意圖。其編碼序列（外顯子）是不連續(xù)的，被非編碼區(qū)（內(nèi)含子）隔斷。 所謂 基因區(qū)域預(yù)測 ，一般是指預(yù)測 DNA序列中編碼蛋白質(zhì)的部分，即外顯子部分。 不過目前基因區(qū)域的預(yù)測已從單純外顯子預(yù)測發(fā)展到整個基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測。這些預(yù)測綜合各種外顯子預(yù)測的算法和人們對基因結(jié)構(gòu)信號(如 TATA盒等 )的認(rèn)識，預(yù)測出可能的完整基因 基因區(qū)域的預(yù)測是一個活躍的研究領(lǐng)域，先后有一大批預(yù)測算法和相應(yīng)程序被提出和應(yīng)用，其中有的方法對編碼序列的預(yù)測準(zhǔn)確率高達(dá) 90%以上，而且在敏感性和特異性之間取得了很好的平衡 預(yù)測方法中，最早是通過序列核苷酸頻率、密碼子等特性進(jìn)行預(yù)測 (如最長 ORF法等 )，隨著各類數(shù)據(jù)庫的建立和完善，通過相似性列線比對也可以預(yù)測可能的基因。同時，一批新方法也被提了出來，如隱馬爾可夫模型 (Hidden Markov Model,HMM)、動態(tài)規(guī)劃法 (dynamic programming)、法則系統(tǒng) (ruledbased system)、語言學(xué) (linguistic)方法、線性判別分析 (Linear Discriminant Analysis,LDA)、決策樹 (decision tree)、拼接列線 (spliced alingment)、博利葉分析 (Fourier analysis)等。 下表列出了 claverie(1997)對部分程序預(yù)測基因區(qū)域能力的比較結(jié)果，表中同時列出了相應(yīng)算法和程序的網(wǎng)址。 目前基因區(qū)域預(yù)測的各種算法均存在以下 2個問題 （ 1）目前算法對基因中的 非編碼區(qū)和基因間序列 不加任何區(qū)別，所以預(yù)測出的基因仍然是不完全的，對 5‘和 3‘非編譯區(qū)（ UTR， untranslated region）的預(yù)測基本上還是空白； （ 2）目前大多數(shù)算法都是 基于已知基因序列 。如相似性列線比較算法是完全依賴于已知的序列，而象 HMM之類的算法都需要對已知的基因結(jié)構(gòu)信號進(jìn)行學(xué)習(xí)或訓(xùn)練，由于訓(xùn)練所用的序列畢竟是有限的，所以對那些與學(xué)習(xí)過的基因結(jié)構(gòu)不太相似的基因，這些算法的預(yù)測效果就要大打折扣了 要解決以上兩個問題，需要對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深入的研究，尋找隱藏在基因不同結(jié)構(gòu)中的內(nèi)在統(tǒng)計規(guī)律。 2．發(fā)現(xiàn)基因的一般過程 從序列中發(fā)現(xiàn)基因可以理解為基因區(qū)域預(yù)測和基因功能預(yù)測 2個層次 第一步：獲取 DNA目標(biāo)序列 ① 如果你已有目標(biāo)序列，可直接進(jìn)入第 2步； ② 可通過 PubMed查找你感興趣的資料；通過 GenBank或 EMBL等數(shù)據(jù)庫查找目標(biāo)序列 第二步：查找 ORF并將目標(biāo)序列翻譯成蛋白質(zhì)序列 利用相應(yīng)工具，如 ORF Finder、 Gene feature(Baylor College of Medicine)、 GenLang(University of Pennsylvania)等，查找 ORF并將 DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列 第三步：在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列搜索 可以利用 BLAST進(jìn)行 ORF核苷酸序列和 ORF翻譯的蛋白質(zhì)序列搜索 第四步：進(jìn)行目標(biāo)序列與搜索得到的相似序列的整體列線 (global alignment) 雖然第三步已進(jìn)行局部列線 (local alignment)分析，但整體列線有助于進(jìn)一步加深目標(biāo)序列的認(rèn)識 進(jìn)行多序列列線 (multiple sequence alignment)和獲得列線區(qū)段的可視信息?？煞謩e在 AMAS(Oxford University)和 BOXSHADE(ISREC,Switzerland)等服務(wù)器上進(jìn)行 第五步：查找基因家族 第六步：查找目標(biāo)序列中的特定模序 ① 分別在 Procite、 BLOCK、 Motif數(shù)據(jù)庫進(jìn)行