【正文】 分子生物學(xué)實驗 任 峰 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 實驗?zāi)夸? 實驗 一 植物基因組 DNA提取及純化 實驗 二 PCR克隆目的基因 實驗 三 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 實驗 四 PCR產(chǎn)物凝膠回收 實驗 五 目的基因片段與載體連接 實驗 六 DH5α和 DE3感受態(tài)細(xì)胞制備 實驗 七 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌 實驗 八 陽性單菌落篩選 實驗 九 重組質(zhì)粒 DNA提取 實驗 十 重組質(zhì)粒及表達(dá)載體 pET酶切分析與電泳 實驗十一 目的片段回收及與表達(dá)載體連接 實驗十二 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α,質(zhì)粒提取 實驗十三 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株 BL21 實驗十四 蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白質(zhì)樣品制備 實驗十五 SDSPAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì) 實驗一 植物基因組 DNA提取 基本原理 1. 基因組 DNA 的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫、Southern 雜交及 PCR 分離基因等。 （植物、動物、微生物）的基因組 DNA 的提取方法有所不同 。 不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。 3. 在提取某種特殊組織的 DNA 時必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗建立相應(yīng)的提取方法 , 以獲得可用的 DNA 大分子。尤其是組織中的多糖和酚類物質(zhì)對隨后的酶切、 PCR 反應(yīng)等有較強的抑制作用 ,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA 時 , 應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。 ? 本實驗是通過 SDS法提取擬南芥基因組 DNA。 ，在生物體中核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為 DNA和 RNA，在真核生物中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)和核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。 SDS提取擬南芥基因組 DNA。 DNA克隆目的基因作準(zhǔn)備 二 實驗?zāi)康? 三、儀器、材料和試劑 儀器及耗材 ： 研缽、微量移液器及吸頭、 EP管、臺式離心機。 材 料 ： 擬南芥小苗 試 劑 ： DNA Extract Buffer ( NaCl, 25mM EDTA, % SDS, pH )。 70%乙醇；酚；氯仿；異丙醇 。RNase 實驗步驟 1. 取一定量的擬南芥組織 。 2. 加入 600 μl抽提緩沖液（ NaCl, 25mM EDTA, % SDS, pH ），室溫下快速研磨 。 3. 把抽提液從研缽中移至 ml 離心管中，混勻 。 4. 12,000 rpm, 離心 10 min (RT)。取上清，加等體積酚 /氯仿（ 1： 1），上下顛倒混勻； 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等體積異丙醇，上下顛倒混勻； 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入 70%乙醇洗沉淀； 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，棄上清，倒置于紙巾上待其干燥； 8 加 20 μl ddH2O溶解沉淀 。 DNA中加入 35μl RNase， 37oC消化 23h。 ddH2O至總體積 400μl，加入等體積的酚 /氯仿，混勻； 11. 12022 rpm, 5min (RT)，取上清入新的 EP管中，用等體積的氯仿再抽提一次 ,12022 rpm, 5min (RT) ； 12. 取上清，加入 1/10體積的乙酸鈉和 2倍體積的無水乙醇，并混勻， 20oC 放置 10 min。 13. 12022 rpm, 10min ,4oC； ， 70％乙醇洗沉淀 ,12022 rpm, 5min ,4oC ； ，沉淀干燥后，加入 ddH2O溶解 DNA 16. 通過分光光度計或電泳檢測 DNA的濃度和純度。 實驗二 PCR克隆目的基因 一 實驗原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) )是一種選擇性體外擴增 DNA 的方法 .它包括三個基本步驟 : (1) 變性 (Denature):目的雙鏈 DNA 片段在 94℃ 下解鏈 。 (2) 退火 (Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度 (56℃ 左右 )下與模板上的目的序列通過氫鍵配對 。 (3) 延伸 (Extension):在 TaqDNA 聚合酶合成 DNA 的最適溫度下 ,以目的DNA 為模板進行合成 . 由這三個基本步驟組成一輪循環(huán) ,理論上每一輪循環(huán)將使目的 DNA 擴增一倍 ,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的 DNA 又可作為下一輪循環(huán)的模板 ,所以經(jīng)2535 輪循環(huán)就可使 DNA 擴增達(dá)待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 PCR原理 FLASH演示 PCR技術(shù)發(fā)展 PCR是 20世紀(jì) 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍。 PCR技術(shù)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。 1985年美國 PECetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。 Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是： ① Klenow酶不耐高溫， 90℃ 會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。 ②引物鏈延伸反應(yīng)在 37℃ 下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其 PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的 DNA片段不均一。 Klenow這些缺點給 PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。 Taq DNA Polymerase 1988年 Saiki 等從水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取耐高溫的 Taq DNA多聚酶 (Taq DNA Polymerase) ， 此酶在93℃ 下反應(yīng) 2h后其殘留活性是原來的 60%。 缺點： Taq DNA Polymerase只有 5’→3’ 聚合酶活性，但沒有 3’ →5’外切活性，無法消除突變和錯配，堿基錯誤摻入率可達(dá) 104/堿基 /循環(huán) Pfu DNA Polymerase Pfu DNA 聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，來自于 Pyrococcus furiosis 菌株，不僅具有摻入反應(yīng)迅速及熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點，更是當(dāng)前市場上所有DNA聚合酶中摻入出錯率最低的一種。 優(yōu)點： Pfu具有 3’ →5’校閱功能，其錯配率分別僅為 107。 缺點：效率低，擴增片段較短 Taq Plus DNA Polymerase 是 Taq和 Pfu DNA 聚合酶的混合物，與 Taq DNA聚合酶相比，具有擴增長度增加（簡單模板可有效擴增 20kb,復(fù)雜模板可有效擴增 10kb), 保真度好的特點；與 Pfu DNA 聚合酶相比，具有擴增速度快，反應(yīng)效率高的優(yōu)勢 。 PCR反應(yīng)體系組成 ? 模板 ? 5’引物和 3’引物 ? 4 種 dNTP ? DNA 聚合酶 ? Mg2+ ? 反應(yīng)緩沖液 1. 模板 ? PCR 反應(yīng)必須以 DNA 為模板進行擴增 , 模板 DNA 可以是單鏈分子 ,也可以是雙鏈分子 ,可以是線狀分子 ,也可以是環(huán)狀分子 ? 就模板 DNA 而言 ,影響 PCR 的主要因素 : 純 度 : 蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制 PCR反應(yīng) 完整性 : 模板降解會導(dǎo)致 PCR擴增無產(chǎn)物 濃 度 : 加量過多導(dǎo)致非特異性擴增增加 2. 引物 ? PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是 PCR 成敗的關(guān)鍵 ? 引物影響因素： 特異性： 長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體 完整性： 避免反復(fù)凍融 濃 度： 應(yīng)適當(dāng) ,過高導(dǎo)致非特異性增加 ,過低則 擴增產(chǎn)物太少 引物設(shè)計原則 (1) 引物長度： 約為 1630b (2) G+C含量： G+C含量通常為 40%60%, 較短引物可粗略估計 Tm＝ 4(G+C)+2(A+T). (3) 四種堿基隨機分布，在 3‘端不存在連續(xù) 3 個 G 或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。 (4) 在引物內(nèi)及兩引物之間 , 尤其在 3‘端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。 (5) 引物 5‘端對擴增特異性影響不大 , 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點。 (6)引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補 4 種 dNTP 濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融 ? dNTP 原液配成 10mM或者 ,20oC貯存。 ? 一般反應(yīng)中每種 dNTP 的終濃度為 20200μM。當(dāng) dNTP 終濃度大于 50mM 時可抑制 Taq DNA 聚合酶的活性 . ? 4 種 dNTP 的濃度應(yīng)該相等 ,以減少合成中由于某種 dNTP 的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。 Mg2+ 過高非特異性嚴(yán)重，過低無擴增產(chǎn)物 ? Mg2+濃度對 DNA 聚合酶影響很大 ,它可影響酶的活性 ,影響引物退火和解鏈溫度 , 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。 ? 通常 Mg2+濃度范圍為 。 ? 試劑公司通常會將 Mg2+加入到 DNA 聚合酶的反應(yīng)緩沖液中： 10 Reaction Buffer (including Mg2+) 10 Reaction Buffer (without Mg2+) DNA 聚合酶 ? Ta