a基因克隆的技術(shù)要點(diǎn)(已修改)
2025-01-24 06:45 本頁面
【正文】 TA基因克隆的技術(shù)要點(diǎn) 08應(yīng)生 狄天元 Page ? 2 主要內(nèi)容 ?（一）重組 T質(zhì)粒的構(gòu)建 ?（二）重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定 1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 2. 重組 DNA的轉(zhuǎn)化 3. 重組質(zhì)粒的鑒定 Page ? 3 TA克隆 ?TA克隆方法 （ Original TA Cloning Kit） 是把 5’A突出的 PCR片斷與一個具有 3’T突出的載體DNA連接起來的方法。 ?PCR反應(yīng)中所適用的聚合酶具有 末端轉(zhuǎn)移 的活性，通常在 5’加上 A。 只有用經(jīng)過特殊處理的具有 3’T突出末端的 DNA片斷才能通過 T/A配對進(jìn)行連接。 ?比平頭連接效率高 50～ 100倍。 Page ? 4 3’A突出的 PCR產(chǎn)物 ?使用不同的 Taq酶，在 PCR擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，加上 72℃ 10分鐘一個過程， Taq酶可以在擴(kuò)增產(chǎn)物的 3末端加上 A 。 ?使用高保真的 DNA聚合酶，如 pfu酶，其不能在擴(kuò)增產(chǎn)物的 3末端加上 A，得到的 DNA序列為鈍端，因此，在回收純化后進(jìn)行加 A的過程，通常是以 PCR回收產(chǎn)物為模板，加上一定量的普通 Taq酶和反應(yīng)液，加入 dATP（或 dNTP）， 72℃ 10分鐘。 Page ? 5 T載體 ?一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，再在 70℃ 或 72℃ 下在只加入 dTTP的反應(yīng)體系中用 Taq DNA聚合酶處理半小時 （也有人報道處理 1～ 2小時能提高克隆效率，這樣加 T反應(yīng)會更徹底） 。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來完成加 T反應(yīng)。載
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