a基因克隆的技術要點(已修改)
2025-01-24 06:45 本頁面
【正文】 TA基因克隆的技術要點 08應生 狄天元 Page ? 2 主要內容 ?（一）重組 T質粒的構建 ?（二）重組質粒的轉化及陽性克隆的鑒定 1. 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 2. 重組 DNA的轉化 3. 重組質粒的鑒定 Page ? 3 TA克隆 ?TA克隆方法 （ Original TA Cloning Kit） 是把 5’A突出的 PCR片斷與一個具有 3’T突出的載體DNA連接起來的方法。 ?PCR反應中所適用的聚合酶具有 末端轉移 的活性，通常在 5’加上 A。 只有用經(jīng)過特殊處理的具有 3’T突出末端的 DNA片斷才能通過 T/A配對進行連接。 ?比平頭連接效率高 50～ 100倍。 Page ? 4 3’A突出的 PCR產物 ?使用不同的 Taq酶，在 PCR擴增循環(huán)結束后，加上 72℃ 10分鐘一個過程， Taq酶可以在擴增產物的 3末端加上 A 。 ?使用高保真的 DNA聚合酶，如 pfu酶，其不能在擴增產物的 3末端加上 A，得到的 DNA序列為鈍端，因此，在回收純化后進行加 A的過程，通常是以 PCR回收產物為模板，加上一定量的普通 Taq酶和反應液，加入 dATP（或 dNTP）， 72℃ 10分鐘。 Page ? 5 T載體 ?一般采用的方法是先把載體用某種限制性內切酶消化成平頭，再在 70℃ 或 72℃ 下在只加入 dTTP的反應體系中用 Taq DNA聚合酶處理半小時 （也有人報道處理 1～ 2小時能提高克隆效率，這樣加 T反應會更徹底） 。也可以用末端轉移酶來完成加 T反應。載
教學課件相關推薦
鄂ICP備17016276號-1