【正文】 畜禽 ＮＢＭ 微生態(tài)制劑 的研制及其應(yīng)用研究 （ ＮＢＭ 技術(shù)源研究） 貴州黔南創(chuàng)先科技有限責(zé)任公司 2022 年 10 月 2 目錄 前言 ?????????????????????????????????? 4 摘要 ?????????????????????????????????? 5 第一章 國內(nèi)外微生態(tài)制劑研究進(jìn)展 ???????????????????? 9 第一節(jié) 益生菌在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究??????????????? 11 第二節(jié) 益生元在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的中應(yīng)用研究??????????????? 16 第三節(jié) 卵 黃免疫球蛋白在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用研究??????????? 18 第四節(jié) 抗菌肽在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究??????????????? 21 第五節(jié) 微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果???????????????????? 24 第六節(jié) 動(dòng)物微生態(tài)制劑應(yīng)注意的事項(xiàng)????????????????? 27 第七節(jié) 畜禽微生態(tài)制劑的研究方向?????????????????? 30 第二章 NBM 微生態(tài)制劑研究綜合報(bào)告 ????????? ?? ??????? 31 第一節(jié) 項(xiàng)目來源?????????????????????????? 31 第二節(jié) 主要研究內(nèi)容??????????????????? ????? 31 第三節(jié) 技術(shù)路線?????????????????????????? 32 第四節(jié) 主要研究結(jié)果???????????????????????? 33 第五節(jié) 討論???????????????????????????? 42 第六節(jié) 項(xiàng)目主要?jiǎng)?chuàng)新???? ?? ?????????????????? 45 第三章 研究分報(bào)告 ?????? ???????????????????? 47 第一節(jié) 微生態(tài)制劑菌種選育研究??????????????????? 47 第二節(jié) 飼用嗜酸乳酸桿菌 LS03 生物特性的研究???????????? 52 第三節(jié) 微生態(tài)活菌 制劑發(fā)酵條件研究????????????????? 57 第四節(jié) 微生態(tài)菌劑生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究????????????????? 69 第五節(jié) 微生態(tài)制劑的包埋技術(shù) ???????????????????? 72 第六節(jié) NBM微生態(tài)制劑飼養(yǎng)斷奶仔豬的效果 ?? ???????????? 78 第七節(jié) NBM微生態(tài)制劑飼養(yǎng)生長豬的效果? ?? ???????????? 84 附件： 3 4 前 言 抗生素在畜禽飼養(yǎng)業(yè)的應(yīng)用，為世 界畜牧業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)，然而也帶來了極大的隱患 — 引起內(nèi)源性感染和二重感染，使畜禽機(jī)體免疫力下降，細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，并可以轉(zhuǎn)移到人體，威脅人類身體健康。因此，自1988 年以來，世界發(fā)達(dá)國家現(xiàn)已開始全面禁止抗生素在飼料中的應(yīng)用。國內(nèi)外許多學(xué)者正在關(guān)注并尋找能夠克服抗生素弊端的代替物，而益生菌、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽等則是目前較理想的具有發(fā)展前途的產(chǎn)品。 近年來，國內(nèi)外對單一的活菌制劑、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽等產(chǎn)品在畜禽飼料上的應(yīng)用研究，均已有較多的報(bào)道。但是，將活菌制劑 — 低聚糖 — 免疫球蛋白有機(jī)結(jié)合 的研究，在一起，形成一種具有特定功能的新型微生態(tài)制劑，則國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究的目的是，采用現(xiàn)代生物技術(shù)，按特殊的生理生化加工工藝，將活菌劑、低聚糖、免疫球蛋白、抗菌肽有機(jī)地結(jié)合起來而研制成的一種新型 NBM 微生態(tài)制劑，充分發(fā)揮免疫球蛋白的特異性免疫功能與益生菌、低聚糖、抗菌肽的非特異性免疫功能及相應(yīng)的生理促進(jìn)功能，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)畜禽生長、預(yù)防和治療感染性疾病的目的。 5 摘 要 近年來，隨著抗生素在飼料添加劑中的禁用，尋求有效抗生素替代品的研究工作，受到人們極大的關(guān)注。而微生態(tài)制劑、低聚糖、 卵黃免疫球蛋白、抗菌肽、中草藥制劑等則是有希望的抗生素代替品。本研究針對人們關(guān)注的這一問題進(jìn)行了研究，取得了如下結(jié)果： 篩選出高產(chǎn)乳酸的乳酸菌菌株。從 126 份豬腸、雞腸、牛瘤胃、豬糞中，近 2022株菌株中，分離篩選出一株高產(chǎn)乳酸的乳酸片球菌（ LS9），乳酸產(chǎn)量高達(dá) 。 采用誘變育種技術(shù)對選育出的乳酸片球菌（ LS9）進(jìn)行了遺傳改良，并最終選項(xiàng)育出一株生產(chǎn)性能更好的乳酸菌（ LS91），該菌能忍耐高濃度（ 10%）葡萄糖，對葡萄糖的轉(zhuǎn)化充高達(dá) 86%90%，產(chǎn)乳酸的能力達(dá)到了 108g/L。 利用重組 DNA 的基因工程技術(shù)，將棒桿菌（ ）賴氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因（ dapA）導(dǎo)入了乳酸片球菌（ LS9）中，使乳酸片球菌（ LS9）既高乳酸又能合成賴氨酸。 探索出活菌制劑混和發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。在生產(chǎn)應(yīng)用中采取分步發(fā)酵法：第一步發(fā)酵時(shí)間為 2427h，溫度 32℃，通氣量為 60 升 /min， pH 值為 6，攪拌速度為 120r/min。適合酵母菌和芽孢桿菌快速生長。第二步發(fā)酵時(shí)間 2427h，溫度 37℃，通氣量為 20 升 /min，pH 值為 6，攪拌速度為 120r/min。適合乳酸菌快速 生長。 本研究比較了葡萄糖、蔗糖、大豆粉、土豆粉、玉米粉、麥麩等六種物質(zhì)作為活菌制劑發(fā)酵的碳源，結(jié)果表明，效果最好的是葡萄糖。乳酸菌工業(yè)發(fā)酵最好的碳源是土豆粉，酵母菌工業(yè)發(fā)酵最好的碳源是大豆粉，芽孢桿菌工業(yè)發(fā)酵碳源上述兩者均可，沒有顯著差異，濃度為 6%。 本研究比較了蛋白胨、植物油、大豆粉、玉米粉、土豆粉、麥麩、尿素等七種物質(zhì)作為活菌制劑發(fā)酵的氮源，結(jié)果表明，效果最好的蛋白胨，濃度為 %，其次是植物油，濃度為 %，尿素也是很好的無機(jī)氮源，但在培養(yǎng)基的高溫滅菌過程中，可能產(chǎn)生縮二脲等有害物質(zhì)， 影響菌體的生長。因此，本研究中排除使用無機(jī)氮源尿素。 本研究比較了低聚木糖、低聚果糖、低聚甘露等三種寡糖對活菌制劑的作用，結(jié)果表明，效果最好的是低聚果糖，但達(dá)到最佳效果需要的濃度較大（ %），達(dá)到最佳作用效果，用量需要最少的是低聚木糖（ %）。 本研究比較了土霉素、金霉素、桿菌肽鋅三種常用的抗生素（濃度為 110 單位 /g）對活菌制劑的影響。結(jié)果表明，三種抗生素對活菌制劑中的任何一種菌種都有抑制作用。 6 活菌制劑的菌種及其數(shù)量 本研究中， NBM 制劑的菌種： 乳酸菌：乳酸片球菌（ LS03LS09LS15）： 108 個(gè) /ml 芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌（ ）： 108 個(gè) /ml 酵母菌：產(chǎn)朊假絲酵母菌（ ）： 108 個(gè) /ml 活菌制劑營養(yǎng)配方： 主體碳源 6%+葡萄糖 2%+蛋白胨 %+植物油 %，另加 %、 Caco31%、%、 %。 豬用活菌制劑，主體菌種乳酸菌，主體碳源土豆粉。反芻動(dòng)物和雞用活菌劑，主菌種為酵母菌，主碳源為大豆粉。 1 NBM 制劑的配方： 本研究中， NBM 微生態(tài)制劑的 主要配方為： 活菌制劑 %+低聚木糖 %+卵黃免疫球蛋白 (IgY)%+蠅蛆抗菌肽蛋白粉 1% 1微膠囊包埋壁材的選擇。研究結(jié)果表明，海藻酸鈉 %+變性淀粉 35%+阿拉伯膠 15%+麥芽糊精 25%+玉米糖漿 20%作為壁材效果最佳，包埋率達(dá) 97%以上。此外， 2%的氯化鈣有利于膠囊的形成和菌種包埋率的保持。 1 NBM 制劑微膠囊包埋產(chǎn)品熱穩(wěn)定性研究。通過 70℃高溫處理 10min，包埋后的產(chǎn)品活菌成活率高達(dá) %，而未包埋的產(chǎn)品活菌成活率只有 %。 1 NBM 制劑酸穩(wěn)定性研究。本研 究通過模擬胃液（含胃酸 10%、胃蛋白酶 1%，PH 值 ）試驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)過 8h 后，包埋產(chǎn)品活菌率還有 32%，而未包埋的產(chǎn)品經(jīng)過 7h 后就完全喪失了活性。 1 NBM 制劑貯藏穩(wěn)定性研究。經(jīng) 6 個(gè)月的貯藏試驗(yàn)顯示，包埋產(chǎn)品活性高達(dá) %，而未包埋產(chǎn)品活菌存活率只有 %。包埋后的產(chǎn)品在更長的貯藏期后的穩(wěn)定性，結(jié)果仍在觀測之中。 1活菌制劑代謝產(chǎn)物抑菌能力研究。研究結(jié)果表明，活菌制劑抑制病原菌起主要作用的是其代謝產(chǎn)物，且代謝產(chǎn)物的濃度越高，抑菌能力越強(qiáng)。代謝產(chǎn)物中起到抑菌作用的不是乳酸，而是 乳酸以外的其他代謝產(chǎn)物，如乳酸菌素等，具體是哪種物質(zhì)仍待進(jìn)一步研究。 1 NBM 制劑抑菌能力的比較。本研究比較了 NBM 制劑、單項(xiàng)活菌劑、單項(xiàng)低聚糖、單項(xiàng)免疫球蛋白、單項(xiàng)蠅蛆抗菌蛋白粉的抑菌能力，結(jié)果表明， NBM 制劑的抑菌能 7 力明顯高于單項(xiàng)物質(zhì)的抑菌能力，但作用效果不是幾項(xiàng)物質(zhì)的數(shù)值累加。 1通過本項(xiàng)研究，謹(jǐn)慎地提出如下理論：微生態(tài)制劑中，死菌具有與活菌相同的作用效果相同。微生態(tài)制劑產(chǎn)品中，強(qiáng)調(diào)菌種的代謝產(chǎn)物含量比強(qiáng)調(diào)菌體的活性更為重要。 1 NBM 制劑在斷奶仔豬中的應(yīng)用效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，斷奶仔豬日增 重比對照提高 %，日采食量提高 %，飼料轉(zhuǎn)化率提高 %，腹瀉率下降近 3 倍。 NBM 制劑在生長豬中的應(yīng)用效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，生長豬日增重比對照提高%，日采食量提高 %，飼料轉(zhuǎn)化率提高 %，產(chǎn)投比為 ： 1，經(jīng)濟(jì)效益提高13%。 8 第一章 國內(nèi)外微生態(tài)制劑研究進(jìn)展 早在上世紀(jì)初（ 1907 年），著名細(xì)菌學(xué)家梅切尼科夫就提出飲用酸奶可以延年益壽的假說，而微生態(tài)制劑用于防治畜禽疾病卻是近 20 年的事。 最早研究和應(yīng)用畜禽微生態(tài)制劑的歷史可以追溯到 1947 年，蒙哈德（ Mollgaard）首先發(fā)現(xiàn)使用乳酸桿菌飼喂仔豬，可以有效地增加仔豬的體重，并改善仔豬的身體健康狀況。然而 20 世紀(jì) 5070 年代，正是抗生素研究、生產(chǎn)和使用的黃金時(shí)期，導(dǎo)致了微生態(tài)制劑的研究和開發(fā)處于低潮，一段時(shí)期以來沒有受到足夠的重視，直到 80 年代中期才有了根本性的變轉(zhuǎn)。 日本是世界上研制開發(fā)和利用微生態(tài)制劑較早的國家之一，其產(chǎn)品主要是雙歧桿菌活菌制劑。在 70 年代雙歧桿菌活菌制劑用于臨床治療腹瀉。至 80 年代中期已有 26 種產(chǎn)品，90 年代已達(dá)到飽和狀況。據(jù)報(bào)道，至今在日本微生態(tài)制劑年產(chǎn)值達(dá) 200 億日元以上的企業(yè)已有 10 余家。 其他許多國家，例如德國、美國、法國、意大利、荷蘭、英國、俄羅斯和韓國等都有不同類型的微生態(tài)制劑產(chǎn)品，有的產(chǎn)品近年來進(jìn)入了我國市場。如英國的 PIC 公司的Protexin，泰國研制生產(chǎn)的 Togocerin，以 %的比例添加到飼料中，可以提高妊娠母豬和泌乳期母豬的生產(chǎn)性能，可以使仔豬的腹瀉率和死亡率明顯下降。加拿大生產(chǎn)的ProsursPaste（主要含芽孢桿菌、糞鏈球菌、雙歧桿菌等）可使育肥豬日增重提高 %。目前國外多使用復(fù)合菌劑。如芬蘭的 Broilact，由 32 種菌組成。日本的 EM 原液由 5 科 10屬 80 余種微生物復(fù)合而成。 產(chǎn)品開發(fā)進(jìn)行得最成功的是美國和日本，到 2022 年止，美國年產(chǎn)各種微生態(tài)制劑 萬噸，產(chǎn)值達(dá) 20 億美元。其次是日本，年產(chǎn)各類微生態(tài)制劑 萬噸，產(chǎn)值達(dá) 3000 億日元。 我國雖然在微生態(tài)制劑的研究和開發(fā)方面比歐美起步晚，但近 10 年來發(fā)展相當(dāng)迅速。生產(chǎn)微生態(tài)制劑的廠家由 2022 年的十幾家發(fā)展到 2022 年的 1600 家。產(chǎn)業(yè)化程度高、規(guī)模較大的有四川何明清用芽孢桿菌研制的 850 870 880 890 901 系列，分別用于仔豬、育肥豬、魚、禽、肉雞。大連醫(yī)學(xué)院研制劑的“促菌生 ”，南京農(nóng)大研的“促康生”，松江制藥廠生產(chǎn)的 DM423 菌粉，黑龍江獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的“痢康粉劑”，北京營養(yǎng)研究所生產(chǎn)的“增菌素”，杭州商學(xué)院生產(chǎn)的乳酸菌復(fù)合劑等等，在此不一一列舉了。市場上應(yīng)用較多、效果較好的大多是以芽孢桿菌和乳酸桿菌為主的復(fù)合益生菌劑。到 2022 年止， 9 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國的各種微生態(tài)制劑的產(chǎn)量已達(dá)到 15 萬噸。但由于國家沒有一個(gè)具體統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊。 目前國際上已將微生態(tài)制劑分成三個(gè)類型。即益生菌（ Probitics）、益生元（ Prebiotics）、合生素（ Synbiotics）。益生菌又稱益生素，或活菌制劑，益生元是一類能夠選擇性地促進(jìn)宿主腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)機(jī)體健康的物質(zhì)。如低聚糖類。合生素是指益生菌和益生元同時(shí)并存的制劑。目前國際上對開發(fā)新微生態(tài)制品的主要方向已從單純的“益生菌”轉(zhuǎn)向“合生素”這一方面。據(jù)日本報(bào)道：實(shí)驗(yàn)研究已證明雙歧桿菌活菌制劑中加入低聚糖后，其效果比不加的提高 10100 倍。 第一節(jié) 益生菌在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用研究 一 、益生菌的概念 動(dòng)物微生態(tài)制劑是根據(jù)動(dòng)物微生態(tài)學(xué)理論，利用動(dòng)物體內(nèi)正常的微生物成員，及其代謝產(chǎn)物或生長促進(jìn)物，經(jīng)特殊的加工工藝制成的制劑。它具 有補(bǔ)充、調(diào)整或維持動(dòng)物腸道內(nèi)微生物平衡，達(dá)到防病、治病、促進(jìn)健康和提高生產(chǎn)性能的目的。益生菌是微生態(tài)制劑的主體。 益生菌又叫活菌制劑，指為改善動(dòng)物微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達(dá)到提高動(dòng)物生產(chǎn)力水平和健康水平，而人工添加的活菌制劑。 二、益生菌的菌種 我國農(nóng)業(yè)部于 1994 年、 1999 年、 2022 年三次公布了可以直接在動(dòng)物飼料中添加的微生物種類， 2022 年農(nóng)業(yè)部第 318 號(hào)公告中，允許使用的微生物有：地衣芽孢桿菌、枯草