【正文】 枸杞組培快速繁殖技術(shù)研究 ① 本文通過對(duì)“寧杞２號(hào)”枸杞離體組織培養(yǎng)的研究，進(jìn)行了叢生芽誘導(dǎo)，試管母本的建立，嫩梢增殖，生根狀況分析及其移栽等方面的探討，進(jìn)而探索了組培快速繁殖以及生產(chǎn)上適用的組培技術(shù)，結(jié)果表明：改良ＭＳ＋ＢＡ０．２＋ＫＴ０．３＋ＮＡＡ０．５和改良ＭＳ＋ＢＡ０．７５＋ＮＡＡ１＋ＩＢＡ０．１交替使用，可加快增殖速度；以較短的根系移栽試管苗，既省工、省力，又能提高成活率，從而確立了一套較為理想的快速繁殖體系，為大規(guī)模工廠化育苗提供了可靠依據(jù) ② 選用“寧杞 2 號(hào)”離體組織進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)和生根狀 況的研究．篩選出了適宜的愈傷組織誘導(dǎo)和生根的培養(yǎng)基．結(jié)果表明，最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 1／ 2MS＋ BA1． 0mg／ L＋ NAA1． 0mg／ L,最適的生根培養(yǎng)基是； 1／ 2MS＋ NAA0． 6mg／ L＋ IBA0． 2mg／ L． ③ 本試驗(yàn)以枸杞嫩枝及頂芽作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。結(jié)果表明 ,不定芽誘導(dǎo)用 MS + 6BA +NAA 。增殖培養(yǎng)基以 MS + 6BA + IBA 。生根培養(yǎng)基為 1/2MS(大量元素減半 ,其它成分不變 ) + + 活性碳 %。 ④ 植物名稱 :寧夏枸杞 (Lycium barbarum) 材料類別 :多年生植株上當(dāng)年萌生出的嫩枝莖尖。培養(yǎng)條件 :基本培養(yǎng)基為 MS。長(zhǎng)芽培養(yǎng)基中的激素成分為 (毫克 /升 ):① ,KT1,② ,BA1。蔗糖濃度為 3％。生根培養(yǎng)基成分為 1/2MS(大量元素減半 ),附加 ,蔗糖濃度 2％。培養(yǎng)溫度 25～ 30℃ ,自然光照。 ⑤ MS 和 MS(1/ 2 大量、微量元素全量 )培養(yǎng)基均適于枸杞的培養(yǎng)、芽增殖和發(fā)根 .在培養(yǎng)基的附加成分中激素的調(diào)節(jié)是重要 的 ,激素以 IBA 濃度在 0～ 10 6 mol/L 均適其培養(yǎng) ,但以 IBA 的濃度為 5 .5 10 7mol/L效果最佳 ,在有機(jī)成份中 VB1 的含量對(duì)發(fā)根有明顯的促進(jìn)作用 .微量全量對(duì)枸杞的發(fā)根是必需的 .MS(1/ 2 大量、微量元素全量 ) +VB12 .96 10 5mol/L +IBA5 .5 10 7mol/L(其他有機(jī)成分常量 )是枸杞芽增殖與發(fā)根同步的最佳培養(yǎng)基 . ⑥ 枸杞屬植物 (Lycium haminifoliumMill)花粉粒發(fā)育成胚和植株的形成已有報(bào) 導(dǎo)。本文報(bào)導(dǎo)枸杞葉外植體的愈傷組織誘導(dǎo)及其植株的再生。從未開花植株上摘取無病蟲害的葉片作材料 ,先用流水沖洗除去塵土 ,然后在70％的酒精中浸 20 秒左右 ,再在含萬分之二昇汞和 5％安替福民的溶液中消毒 4～ 5 分鐘 (消毒時(shí)間不能過長(zhǎng) ,以免傷害葉片 )。用無菌水淋洗 3～ 5 次后 ,在無菌條件下將葉片橫切成 1 厘米左右的切段 ,接種在 Murashige和 Skoog 培養(yǎng)基上 ,培養(yǎng)基附加激動(dòng)素 (K),吲哚乙酸 (IAA) 或 ,IAA 枸杞髓組織離體培養(yǎng)及高頻率植株再生的研究 * 曹有龍 陳 放 羅 青 曲 琳 摘 要 ： 枸杞髓組織在 4 種 MS 培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率%～ 100%。在培養(yǎng)基 MS + 6BA mg/L + NAA mg/L 獲得的愈傷組織，呈顆粒狀，分散性能好，胚性細(xì)胞多。將其轉(zhuǎn)移到 MS + 6BA mg/L + NAA mg/L 的分化培養(yǎng)基上獲得大量綠色小芽，小芽在 MS + 6BA mg/L 的培養(yǎng)基上得到快速繁殖，繁殖系數(shù) 50～ 150 株 /芽 .月。叢生芽在 MS + NAA mg/L 的培養(yǎng)基上形成完整植株。 關(guān)鍵詞 ：枸杞；髓組織；離體培養(yǎng)；植 株再生 枸杞（ Lycium barbarum L.）是重要的藥用植物，多年來，國(guó)內(nèi)外科技工作者十分重視枸杞的組織培養(yǎng)，已有用葉片、花藥、下胚軸、莖端及幼嫩子房為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)分化出植株的 〔 1,2,3〕 ，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上，以枸杞髓組織為試驗(yàn)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了再生植株，為枸杞細(xì)胞突變體的篩選、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)分離、細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移的研究提供依據(jù)。 1 材料和方法 試驗(yàn)材料 供試材料為寧夏農(nóng)科院枸杞研究所培育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)枸杞新品種 —— 寧杞１號(hào)。 愈傷組織的誘導(dǎo) 取當(dāng)年生長(zhǎng)的明顯分 化成髓組織的枝條，摘除葉子、側(cè)芽和帶有分生組織的頂端 100 mm，把外植體的切端蘸熔蠟封著傷口，然后浸入 70％酒精中 20 s，再轉(zhuǎn)入 %HgCl2溶液中，經(jīng)過 8～10 min 后，用無菌水沖洗 3 遍，最后以吸水紙吸干，從莖的兩端各切除10 mm，余下部分切成 20 mm 的小段，用無菌鑷子夾著莖的切段，用瓶塞打孔器從切段中取出圓柱體髓組織，并將其轉(zhuǎn)移到 90 mm 的無菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀切成 2～ 3 mm 厚的小圓片，接種到 4 種含不同激素的 MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。 愈傷組織的繼代培養(yǎng) 在 P2培養(yǎng) 基中加入 500 mg/L 的水解酪蛋白作為繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基。挑選色澤鮮艷、生長(zhǎng)迅速的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每次 20 d， 2～ 3 次繼代后，出現(xiàn)疏松顆粒狀胚性愈傷組織，選擇顆粒較細(xì)的愈傷組織，加快繼代頻率（ 2 周 1 次），當(dāng)愈傷組織易碎，顆粒均勻且生長(zhǎng)迅速時(shí)，改為 3 周 1 次保存之。 分化培養(yǎng) 將上述繼代過程中產(chǎn)生的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含不同濃度的 6－ BA 和 NAA 的 MS 培養(yǎng)基上， 4 周后觀察不同培養(yǎng)基上愈傷組織的分化出芽情況。 生根培養(yǎng) 選擇較為健壯的叢生芽，切除底部的葉片，只保留上部 2～ 3 片葉，插入 生根培養(yǎng)基中， 3 周后觀察其生根情況。 在上述各步驟中，各外植體均接種于容量為 120 ml 的三角瓶中，每瓶 3～ 4 個(gè)外植體，每處理 3～ 4 次重復(fù)。培養(yǎng)條件：溫度 20～ 25 ℃ ，每日光照 10～ 12 h，光照強(qiáng)度為 2 500～ 3 000 lx。 2 結(jié)果與分析 愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng) 枸杞髓組織切片接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 3 d 后開始膨大，在切面上開始形成白色愈傷組織（圖版 Ⅰ: 1），其中 P1培養(yǎng)基誘導(dǎo)頻率最高，可達(dá)%； P3與 P4培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織白色緊密，不易分散，經(jīng)過 30 d繼代培養(yǎng)，有的可直接分 化出苗，但頻率很低（表 1），而 P2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織為淡黃色松散型，這種愈傷組織繼代轉(zhuǎn)接后能迅速生長(zhǎng)，多次繼代培養(yǎng)后，顆粒小，分散好，難以用鑷子夾起來，而且胚性細(xì)胞多，分化頻率高。 表１ 枸杞髓組織在不同激素配比培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)情況 Table 1 Effects of hormones on calli induction of Lycium barbarum tissue 培養(yǎng)基編號(hào) medium 培養(yǎng)基組分 (mg/L) Contents of medium 開始 啟動(dòng)時(shí)間 (d) Time of calli produced 接種塊數(shù) (塊 ) Number of explants planted 出愈塊數(shù) Number of explants with calli induction 誘導(dǎo)頻率 (%) Percentage of calli induction P1 MS+2,4D 3 95 95 100 P2 MS++ 10 95 75 P3 MS++ 14 95 70 P4 MS+NAA + 14 95 51 2, 4D 對(duì)愈傷組織繼代的影響 在 P1 培養(yǎng)基中，我們加入植物激素 2,4D mg／ L 誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，誘導(dǎo)率為 100%。這說明 2,4D 對(duì)枸杞愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用，將其轉(zhuǎn)入含不同激素成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果如表 2。 表 2 2,4D 對(duì)枸杞愈傷組織的影響 Table 2 Effects of 2,4D on calli of Lycium barbarum L. 培養(yǎng)基編號(hào) medium 激素濃度 (mg/L) Hormone concentration 生長(zhǎng)情況 Growth status 褐化時(shí)間（ d） Time of calli bee brown 愈傷組織特點(diǎn) Calli characteristics （ 1） MS+2,4D2 ++++ 10 白色水質(zhì)狀，生長(zhǎng)快 （ 2） MS+2,4D1 +++ 12 白色水質(zhì)狀，生長(zhǎng)快 （ 3） MS+2, ++ 25 白色松散，生長(zhǎng)較快 （ 4） MS+2,+CH ++ 28 白色松散，生長(zhǎng)較快 （ 5） MS+2,+ + 2 白色緊密，顏色由白 轉(zhuǎn)綠 （ 6） MS++ +++ － 淡黃色，顆粒狀 注 :愈傷組織生長(zhǎng)情況分四級(jí) :+很少 ++少 +++中等 ++++大量 Four classes were divided according to the callus growth:+very small ++small +++medium ++++large. 表 2 可以看出 , 2, 4D 對(duì)枸杞愈傷組織的形成在一定范圍內(nèi) (～2 mg／ L)隨 2, 4D 濃度的增加 , 愈傷組織生長(zhǎng)加快 , 但褐化時(shí)間提前。當(dāng) mg／ L 2, 4D 與 mg／ L KT 配合使用時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度很低，而且變得十分堅(jiān)硬，顏色也由白色轉(zhuǎn)為綠色，近培養(yǎng)基部分 2d 后出現(xiàn)褐化；培養(yǎng)基中添加 500 mg／ L CH 對(duì)愈化組織的生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)作用。 當(dāng)把培養(yǎng)基含 2, 4－ D mg／ L 誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到 P2培養(yǎng)基后，愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭w粒狀胚性愈傷組織，與 P2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織物質(zhì)很相似 (圖版 Ⅰ: 2) 。因此，如果用含 2, 4－ D mg／L 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，用 P2培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，將獲得大量顆粒狀胚性愈傷組織。因此，這種方法是枸杞進(jìn)行離體快繁較為適宜的途徑。 表 3 不同植物激素對(duì)枸杞愈傷組織分化頻率的影響 Table 3 Effects of different hormones on differentiation rate of Lycium barbarum 培養(yǎng)基 (mg/L) Medium 分化頻率（％） Regeneration rate 每塊愈傷組織平均的苗數(shù)（個(gè)） Average number of shoots on a single callus 特征 Characteristics 6BA2 100 12 大多數(shù)玻璃化 6BA1 90 10 部分玻璃化 97 8 正常 + 90 10 芽基部有愈傷組織 產(chǎn)生 + 93 11 正常 分化培養(yǎng) 將經(jīng)過 P2 培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng) 15 d 的愈傷組織轉(zhuǎn)入附加 3% 蔗糖、 % 瓊脂， 500 mg／ L CH, ～ 含不同 6BA 濃度的 MS 分化培養(yǎng)基，兩周后開始形成芽點(diǎn)，可進(jìn)一步發(fā)展成芽叢 (圖版 Ⅰ :3），所做不同植物激素配比試驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞愈傷組織芽的分化需要一定濃度使用的 5 種含 6BA 的培養(yǎng)基分化頻率都在 90％以上， 6BA 濃度高 , 每塊愈傷組織得苗數(shù)多 , 但玻璃化苗也多 , 6BA 與NAA 配合使用 , 能顯著提高愈傷組織的分化頻率 , 但同時(shí)愈傷組織也得到增殖 , 分化得到的苗必須及時(shí)轉(zhuǎn)移，否則苗的基部又會(huì)轉(zhuǎn)化為愈傷組織。單獨(dú)使用 6BA ，濃度為 mg／ L 或者附加 NAA ／ L 時(shí)愈傷組織分化頻率略為下降，但 分化出的苗正常，比較幾種培養(yǎng)基分化出苗的結(jié)果，以 MS+6BA ／ L+NAA mg／ L 結(jié)果最好 (表 4)。 表 4 枸杞芽的擴(kuò)繁 Table 4 Reproduction of buds 培養(yǎng)基 Medium 繁殖系數(shù)（株／月 .芽） Coefficient of reproduction 特征 Characteristics MS+6BA1 05 轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡЩ? MS+ 1030 部分有玻璃化現(xiàn)象 MS+ 50150 正常苗 芽的 擴(kuò)增 在愈傷組織上分化形成的芽，等長(zhǎng)到 2 cm 高時(shí)，將其沿基部切下，轉(zhuǎn)入含不同 6BA 濃度的培養(yǎng)基中，使其擴(kuò)增，結(jié)果如表 5。從表 5 可以看出，以 MS + 6BA mg／ L 時(shí)，芽生長(zhǎng)正常，經(jīng)過 20 d 的培養(yǎng)，每芽可產(chǎn)生 50～ 150 株無根苗（圖版 Ⅰ ： 4），但 BA 為 1 mg／ L 時(shí)，芽不能進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng) 20 d 后就轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡЩ纾?6BA mg／ L 的培養(yǎng)基雖能進(jìn)行擴(kuò)繁，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分也轉(zhuǎn)化為玻璃化苗。 生根培養(yǎng) 將叢生芽沿基部切下，接種到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，結(jié)果如表 5． 表 5 不同植物激素濃度對(duì)枸杞幼芽生根的影響 Table 5 Effects of different hormones of Lycium barbarum L 培養(yǎng)基（ mg／ L） Medium 接種苗數(shù)（個(gè)） Number of planted shoots 生根芽數(shù)（個(gè)） Numb