酶工程實(shí)驗(yàn)生物工程(已修改)
2025-01-18 15:53 本頁面
【正文】 本實(shí)驗(yàn)共有六個(gè)分實(shí)驗(yàn) : 實(shí)驗(yàn)一 酵母蔗糖酶的純化與純度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)二 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定純度 實(shí)驗(yàn)三 酵母蔗糖酶的結(jié)晶（選做） 實(shí)驗(yàn)四 蔗糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究 實(shí)驗(yàn)五 酵母蔗糖酶的固定化 實(shí)驗(yàn)六 酵母蔗糖酶活性功能基團(tuán)的化學(xué)修飾 酵母中含有豐富的蔗糖酶 () 細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)，含有少量的糖。 外蔗糖酶 內(nèi)蔗糖酶 細(xì)胞膜的外側(cè)，占蔗糖酶活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。 由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。 實(shí)驗(yàn)一 酵母蔗糖酶的提取與純化 本實(shí)驗(yàn)以酵母為原料，通過破碎細(xì)胞、加熱除雜蛋白、乙醇沉淀、離子交換柱層析等步驟，分離純化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝膠電泳對(duì)其純度進(jìn)行初步檢驗(yàn)。 有機(jī)溶劑分級(jí)的原理：有機(jī)溶劑分級(jí)是利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。 其原理是： 有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)溶解度下降； 有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。 結(jié)合力的大小取決于 彼此之間相反電荷基團(tuán)的 靜電引力 靜電引力 大小與溶液的 pH值有關(guān)，因 pH值決定蛋白質(zhì)的解離程度 。 NH3 R COOH + NH3 R COO + R NH2 COO Low pH Positive charge High pH Negative charge Hydrogen gained Hydrogen lost 陽離子交換劑 樣品溶液 pH＜ pI時(shí)，酶帶正電荷； 陰離子交換劑 樣品溶液 pH＞ pI時(shí)，酶帶負(fù)電荷 一般樣品溶液的 pH與酶 pI相差一個(gè) pH以上 樣品溶液的 pH與酶 pI相差越大的，帶電荷越多 通過 逐漸增加洗脫液離子強(qiáng)度的梯度洗脫 方式，可使結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)按照 結(jié)合力由小到大 的順序依次被洗出層析柱。 Sample application and wash Elution Equilibration Regeneration + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + a n i o ne x c h a n g e rbead 本實(shí)驗(yàn)中使用的 DEAE52是弱堿性的 陰離子 纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為 二乙基氨乙基（ DEAE） 。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。 控制：樣品溶液 pH＞ pI時(shí)，酶帶負(fù)電荷 離子交換柱層析的原理： 根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)在分離過程中，以離子交換劑作用為主導(dǎo)。在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)是： 開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對(duì)蛋白質(zhì)吸附容量大； 纖維素上離子基團(tuán)數(shù)量不多且排列疏散，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離目的，不致引起蛋白質(zhì)變 用其裝好的層析柱在較廣的 pH和鹽濃度范圍內(nèi)都不會(huì)發(fā)生體積的改變，所以有利于蛋白質(zhì)層析。 本實(shí)驗(yàn)中使用的 DEAE52是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為二乙基氨乙基（ DEAE） 。該纖維素的吸附量 大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。 為了確定哪個(gè)峰是含目標(biāo)酶，要 進(jìn)行酶活力的測(cè)定 ； 用蔗糖做底物反應(yīng)一段時(shí)間后，檢測(cè)生成的葡萄糖的量；用尿糖試紙初步檢測(cè)；用 DNS法精確檢測(cè)。 Sucrase（ 蔗糖酶 ） glucose＋ fructose Sucrose Semiquantitative assay of yeast sucrase activity with UGlu testtape Sucrose glucose oxidase（ 葡萄糖氧化酶 ） gluconic acid＋ H2O2 （葡萄糖酸 ） H2O+O2
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