elisa實驗ppt課件(已修改)
2025-01-18 14:07 本頁面
【正文】 1. ELISA的原理 2. ELISA的類型 3. 試劑準(zhǔn)備 ： 免疫吸附劑 結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備 4. 對照設(shè)定 5. 標(biāo)本的采取和保存 6. 結(jié)果判斷 ELISA是一種免疫測定（ immunoassay， IA） ?；A(chǔ) :抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。 1. ELISA的原理 酶免疫測定類型 這種固相酶免疫測定方法在 1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），簡稱 ELISA。 酶免疫技術(shù) 酶免疫組化 酶免疫測定 均相酶免疫測定 非均相酶免疫測定 固相酶免疫測定 液相酶免疫測定 抗原抗體反應(yīng) 可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為： Ag+Ab→Ag Ab 抗體的親和力（ affinity），可以用平衡常數(shù) K表示：K=[AgAb]／ [Ag][Ab] ,AgAb的解離程度與 K值有關(guān)。 高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。 解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。 特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。 最適比例 敏感性 化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml水平 酶反應(yīng)測定法的敏感度約為 510μg/ml 免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá) ng/ml水平 例如， HBsAg，其敏感度可達(dá) 。 免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用 由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣。 2 ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑： （ 1）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑 （ immunosorbent） ； （ 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物 （ conjugate） ； （ 3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。 雙抗體夾心法測抗原 此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、 AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于 包被固相載體 和制備 酶結(jié)合物 而建立此法。 雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗 HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。 間接法測抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體 建立檢測相應(yīng)抗體的方法。 競爭法測抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。 競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的 位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。 捕獲包被法測抗體 IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人 IgM抗體包被固相
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