人類染色體疾病的診斷三(已修改)
2025-01-17 23:22 本頁面
【正文】 第五節(jié) 熒光原位雜交（ FISH） 染色體顯帶技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) ? 染色體顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù) 中不可替代的基本方法。 “金標(biāo)準(zhǔn)” ? 操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì) ? 可以提供核型的完整圖像 ? 影響因素： ? 染色體相似性很強(qiáng)，復(fù)雜畸變時(shí)；或畸變微?。ㄈ缛笔?5Mb)，不足以引起圖像明顯變化時(shí)，結(jié)果分析困難。 ? 耗時(shí)（培養(yǎng)需 72小時(shí)）且 依賴于獲得良好的分裂相 ，而有的標(biāo)本中分裂指數(shù)低，或染色體形態(tài)學(xué)表型差。 一、 FISH原理 （一）、幾個(gè)概念 ?雜交 ?原位雜交 ?熒光原位雜交 依據(jù) DNA雙鏈堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針檢測(cè)樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列，這一過程叫做雜交。 原位雜交 (in situ hybridization)是用已標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸中的互補(bǔ)序列雜交 ,從而對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。 原位雜交 ? 1）同位素原位雜交 (Isotopic in situ hybridization)—— 70年代 ? 2）非同位素原位雜交 (Nonisotopic in situ hybridization)—— 80年代中后期 ? （ 1）免疫酶聯(lián) ? （ 2）熒光原位雜交（ Fluorescence in situ hybridization, FISH)** 同位素原位雜交的不足： 1）不穩(wěn)定； 2）高背景； 3）曝光時(shí)間長(zhǎng)； 4）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣 。5）同位素的使用和處理 熒光原位雜交（ FISH） ? FISH技術(shù)是 常規(guī)染色體分析 的輔助手段。它是用熒光素標(biāo)記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號(hào)來判斷結(jié)果 。 ? 它可用于標(biāo)記染色體的識(shí)別、特異融合基因的 檢測(cè)，并可廣泛用于腫瘤的診斷分型，新 基因定位，用全染色體涂抹探針識(shí)別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu) 異常等。 原理：通過觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況。 二、 FISH的優(yōu)點(diǎn)： ，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年。 ，能迅速得到結(jié)果。 ，可同時(shí)幾種不同 探針，顯示DNA片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確；可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型。 究，而且還可用于靜止期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究 。 三、 FISH探針 ? 用生物素或地高辛標(biāo)記稱為 間接 標(biāo)記。 雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測(cè)方能看到熒光 信號(hào)。 ?優(yōu)點(diǎn)：在信號(hào)較弱或較小時(shí)可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大 ?缺點(diǎn) 步驟較多 , 操作麻煩。 （一）、直接標(biāo)記和間接標(biāo)記 直接用熒光素標(biāo)記 DNA的方法稱為 直接標(biāo)記 。 ?優(yōu)點(diǎn)：由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號(hào) , 省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng)。由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進(jìn)和提高 , 直接標(biāo)記的熒光探針應(yīng)用越來越多。 探針標(biāo)記 ? 在已知探針 DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用PCR或 RNA逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常用 Biotin標(biāo)記的探針應(yīng)大于 100bp，較小的探針可采用 PCR技術(shù)來標(biāo)記。 ? 近年來， VYSIS公司成功的生 產(chǎn)了大片段的DNA探針（ 100─400kb）。由于探針較長(zhǎng)，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進(jìn)一步簡(jiǎn)化面且雜交信號(hào)增強(qiáng)。 （二）、 FISH探針的種類 1）單拷貝探針： （ 1）種類：酵母人工染色體（ YAC），細(xì)菌人工染色體（ BAC）， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （ 2）應(yīng)用 （ a）定位 DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證； （ b）確定染色體微小缺失與重復(fù)； （ c）染色體斷裂點(diǎn)分析。 ２）簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針 (simple repetitive probes） 其靶序列為 α衛(wèi)星 DNA或衛(wèi)星 III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色體的著絲粒， 異染色質(zhì)區(qū)域和端粒
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