【正文】 第十三章 血栓與止血檢驗(yàn) 編輯制作 熊石龍 一、基本理論 ? 血管壁的正常結(jié)構(gòu)包括三層：內(nèi)層、中層和外層 內(nèi)層：內(nèi)皮細(xì)胞 +基底膜 內(nèi)皮細(xì)胞管壁有肝素類物質(zhì) 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)含細(xì)胞器 （棒狀小體 vWF和 tPA， TM， ATⅢ,PAI 1等 ） 中層：平滑肌細(xì)胞（脈細(xì)血管無此層） 外層：結(jié)締組織 血管壁的結(jié)構(gòu) 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 激活血小板 激活凝血過程 抗血栓特性 收縮反應(yīng) 血管壁的止血功能 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 一、基本理論 血小板的止血功能 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 血管損傷（抗血栓特性降低） 血管收縮 激活凝血過程 血流減慢 纖維蛋白形成 血管內(nèi)皮下成分暴露 血小板黏附、聚集、釋放 血栓形成 血漿血管性血友病因子抗原 vWF:Ag， ELISA法 原理純化的兔抗人 vWF:Ag抗體包被聚苯乙烯反應(yīng)板，加入稀釋的待測(cè)血漿，樣本中的 vWF:Ag結(jié)合于固相的抗體上，然后加入酶標(biāo)記兔抗人 vWF:Ag抗體，與其定量結(jié)合，洗去多余抗體后，加底物顯色，通過查找標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出 vWF:Ag的含量。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 二、血管壁（內(nèi)皮）檢驗(yàn) vWF:Ag 操作 ? 單抗以 （ ）稀釋成10μ g/ml加入反應(yīng)板中，每孔 ，置于濕盒中 4℃過夜。 ? %Tween— 20， （ ，Tween— PBS）洗 3次后加入用 %BSA— PBS稀釋的待測(cè)血漿或培養(yǎng)液上清，每孔 ， 37℃ 溫育 2小時(shí)。 ? 同前洗滌 3次后，加入用同上緩沖液稀釋的酶標(biāo) vWF單抗，每孔 ， 37℃ 溫育 2小時(shí)。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) vWF:Ag 操作 ? 同前洗滌 5次后，每孔加底物溶液（ OPD 1mg/ml，用， ， 30%過氧化氫 g/ml） ，置室溫約 5分鐘后，各孔加3mol/L硫酸 。 ? 室溫放置 10min后在酶標(biāo)儀上測(cè)定 492nm處的吸光度值。 ? 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 正?；旌涎獫{以 %BSA— PBA按 1： 1： 50、 1： 100、 1： 200、 1： 500、 1： 1000六種濃度稀釋，與待測(cè)樣品在相同條件下測(cè)定。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 參考值： %～ % 注意事項(xiàng) 對(duì)血漿 vWF： Ag濃度過高的標(biāo)本，應(yīng)稀釋后再測(cè)定。 所有 ELISA測(cè)定中應(yīng)注意的事項(xiàng)均應(yīng)引起重視。 除本方法外，也可以采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) vWF:Ag 參考區(qū)間 vWF:Ag 應(yīng)用評(píng)價(jià) 血管性血友病因子抗原測(cè)定主要用于血管性血友病的診斷和鑒別診斷 見于血管性血友?。?vWD），是診斷 vWD及其分型的重要依據(jù) 見于血栓性疾病，如急性冠脈綜合征（ ASC）、心肌梗死、 腦血管病變、妊娠高血壓綜合征、腎小球疾病等，同時(shí)也見 于劇烈運(yùn)動(dòng)后，腎上腺素受體被興奮等。 應(yīng)用評(píng)價(jià)以前 vWF： Ag定量常采用免疫火箭電泳，由于操作較為復(fù)雜，現(xiàn)在少用。 ELISA常用于定量檢測(cè) vWF： Ag，但是膠乳增強(qiáng)的免疫比濁法更為簡(jiǎn)便快速，而且可以在全自動(dòng)血凝儀上進(jìn)行測(cè)定。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 凝血酶調(diào)節(jié)蛋白， TM 原理將抗人凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（ Thrombomdulin,TM）單克隆抗體包被于聚苯乙烯放免小杯中，樣本中的 TM結(jié)合于包被的放免小杯上，加入 125I抗人 TM單抗，根據(jù)結(jié)合的 125I放射性強(qiáng)度計(jì)算出樣品中 TM的含量。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) TM 操作 人 TM標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液 A做倍比稀釋， TM的濃度分別為 500， 250， 125， ， ， , 0ng/ml,以人 TM濃度為橫坐標(biāo)，以 cpm為縱坐標(biāo)繪制校正曲線。 200μl的抗人 TM單抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中， 4℃ 過夜，用洗滌液 A洗 3次，將待測(cè)樣本（或標(biāo)準(zhǔn)品） A混合，每小杯加入 20μl稀釋樣品液（空白管加入緩沖液 A）， 37℃水浴 2h，用洗滌液 A洗 3次，加入 200μl125I抗人 TM單抗， 37℃ 水浴 2h，再用洗滌液 B洗六次，在 γ閃爍測(cè)定儀上測(cè)定放射活性，在校正曲線上查出相應(yīng)的濃度。 TM 參考區(qū)間 25～ 52μg/L 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) TM是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌釋放的 ， 它表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面 ， 和循環(huán)血液中的凝血酶形成 1： 1的 TM凝血酶復(fù)合物 ， 此復(fù)合物將蛋白 C（ PC） 激活為活化蛋白 C（ APC） ， APC有滅活 FⅧa 、 FⅤa 和激活纖溶活性的作用 ， 因此 TM對(duì)于血管的抗凝作用十分重要 。 正常情況下 ， 血漿中 TM的含量很低 ， 但當(dāng)血管內(nèi)皮受損后 ， 血漿中的 TM含量明顯升高且與內(nèi)皮的損傷程度相關(guān) 。 目前認(rèn)為 ， TM:Ag的檢測(cè)是了解血管內(nèi)皮損傷最好的指標(biāo) 。 TM:Ag的水平升高 見于血栓性疾病 ， 如糖尿病 、 心肌梗死 、 腦血栓 、 深靜脈血栓形成 （ DVT） 、 DIC等 。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) TM 應(yīng)用評(píng)價(jià) TM 注意事項(xiàng) ，應(yīng)在采血后立即將血漿分離出放于 20℃ 冷凍保存。冷凍的樣品復(fù)溶時(shí)應(yīng)在 37℃水浴中進(jìn)行，室溫中緩慢解凍則可導(dǎo)致 TM沉淀。 2. 若樣本中的 TM含量超過校正曲線范圍應(yīng)適量稀釋后再次測(cè)定 。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 血漿 6酮 前列腺素 F1α檢測(cè) 原理 ELISA法：將抗原（血漿 6酮 前列腺素 F1α 牛血清白蛋白連接物）包被于固相載體上，與游離抗原（待測(cè)樣品或 6酮 前列腺素 F1α 標(biāo)準(zhǔn)品）競(jìng)爭(zhēng)性地與一定量的抗 6酮 PGF1α 抗體結(jié)合，洗滌后加入過量的酶標(biāo)記第二抗體，再加入底物顯色。待檢血漿或標(biāo)準(zhǔn)品中的 6酮 PGF1α 含量與顯色程度呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)顯色程度（ A值）即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中推算出待檢血漿中 6酮 PGF1α 的含量。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 血漿 6酮 前列腺素 F1α 檢測(cè) 操作步驟 順利采取靜脈血后與 5%EDTANa2進(jìn)行 9： 1抗凝混勻， 3000r/min離心 20min分離出血漿。 6酮 PGF1α BSA作一定稀釋后包被于酶標(biāo)反應(yīng)板，再用 %明膠封閉。加入標(biāo)準(zhǔn)品（倍比稀釋成~1600pg/ml 濃度）或待測(cè)樣品、兔抗 6酮 PGF1α IgG100μ l后在 37℃ 中溫育 2h。洗滌后再加入酶標(biāo)第二抗體 200μ l在 37℃ 反應(yīng) 2h。以 OPD過氧化氫為基質(zhì)顯色 20min，加入 3mol/L硫酸中止反應(yīng)，在酶標(biāo)檢測(cè)儀上測(cè)定 490nm處的吸光度值 A。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 血漿 6酮 前列腺素 F1α 檢測(cè) 參考區(qū)間 標(biāo)準(zhǔn)曲線與計(jì)算 式中 :B為測(cè)定管； B0為不加樣品管，最大結(jié)合率管；B/B0為結(jié)合率。 以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)， B/B0（ %）為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品孔 B/B0（ %）值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出 6酮 PGF1α 的含量。 樣品 6酮 PGF1α 濃度（ pg/ml） =測(cè)定值 10。 參考范圍 ～ pg/ml。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) 100%A—A A—AB/ B0(%) ?? 非特異零標(biāo)準(zhǔn)孔 非特異標(biāo)準(zhǔn)品或樣品血漿 6酮 前列腺素 F1α 檢測(cè) 應(yīng)用評(píng)價(jià) 血漿 6酮 前列腺素 F1α 是血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上 PGG2和 PGH2代謝的終末產(chǎn)物，檢測(cè)血漿中 6酮 前列腺素F1α 的水平能客觀的反映血管內(nèi)皮的功能，有助于對(duì)血管內(nèi)皮損傷程度的了解和療效評(píng)價(jià)。 血漿 6酮 前列腺素 F1α 減低 見于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心絞痛、腦血管病變、動(dòng)脈粥樣硬化、周圍血管血栓形成及血栓性血小板減少性紫癜等。 第十三章 第一節(jié) 血管壁的止血作用及檢驗(yàn) ? 了解血小板的超微結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上理解血小板的止血功能。 ? 理解并掌握血小板止血功能實(shí)驗(yàn)室檢查的臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)。 學(xué)習(xí)要點(diǎn) 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 一、基本理論 ? 血小板（ blood platelet）由骨髓中成熟巨核細(xì)胞的胞 質(zhì)分割生成，是哺乳動(dòng)物血液中體積最小的血細(xì)胞。 ? 血小板數(shù)量： (100～ 300) x109個(gè) /L（成年人）。 ? 血小板壽命： 7～ 10天。 ? 主要功能：促進(jìn)止血和加速凝血，在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理過程中起重要作用。 血小板概述 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 血小板結(jié)構(gòu) 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) ? 光學(xué)顯微鏡：一般表現(xiàn)為多形態(tài)，直徑 1～ 4μ m，具有運(yùn)動(dòng)和變形能力。瑞氏染色后見血小板胞質(zhì)呈灰藍(lán)色或淡紅色，無胞核，中心部位有較多紫紅色嗜苯胺藍(lán)顆粒。 ? 電子顯微鏡：血小板結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)可分為表面結(jié)構(gòu)、溶膠質(zhì)層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器內(nèi)含物三層。 1．血小板表面結(jié)構(gòu) 由血小板膜、細(xì)胞外衣和開放管道系統(tǒng)（ open canalicular system， OCS）組成。 重要成分：磷脂酰絲氨酸 （ phosphatidylserine， PS） /血細(xì)胞第 3因子（ PF3） 血小板膜糖蛋白等。 2．溶膠質(zhì)層結(jié)構(gòu) 由微管、微絲、致密管道系統(tǒng)等組成。 3．細(xì)胞器內(nèi)含物結(jié)構(gòu) 主要致密顆粒和 α 顆粒、溶酶體組成。 血小板超微結(jié)構(gòu) — 功能基礎(chǔ) 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 花生四烯酸是膜磷脂代謝產(chǎn)物，其代謝途徑是血小板發(fā)揮聚集止血功能的主要代謝基礎(chǔ)。 血小板的花生四烯酸代謝途徑 血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)完成 2～ 3min后 前列環(huán)素 合成酶 血栓烷 A2 合成酶 環(huán)氧化酶 花生四烯酸 膜磷脂 磷脂酶 A2 前列腺素環(huán)內(nèi)過氧化物 PGG2 過氧化物酶 前列腺素環(huán)內(nèi)過氧化物 PGH2 前列環(huán)素 （ PGI2） 血栓烷 A2（ TXA2） 30s后 6酮 PGF1α （ 穩(wěn)定產(chǎn)物 ） 血栓烷 B2（ TXB2） （穩(wěn)定產(chǎn)物） 血小板內(nèi)完成 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 血小板粘附 促凝作用 血小板聚集 釋放反應(yīng) 血塊收縮 血小板的止血功能 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 血小板的止血功能 血小板的止血功能 ADP 血小板進(jìn)一步激活 、 釋放 血塊收縮 內(nèi)皮損傷 （ 內(nèi)皮下組織暴露 ） 血小板粘附 血小板初期釋放 ADP等 血小板聚集 纖維蛋白形成 堅(jiān)固的凝血塊 血小板促凝作用 5HT 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 類 別 成分 活性胺 5HT，組胺，腎上腺素，去甲腎上腺素 腺嘌呤核苷酸 ADP,ATP,cAMP 陽離子 Ca2+, K+ 血小板因子 PF3, PF4等 凝血因子 凝血因子 I， V， VIII， XIII 血小板蛋白 βTG，血小板糖蛋白等 血栓烷 TXA2 血小板的主要釋放產(chǎn)物 血小板功能的實(shí)驗(yàn)室檢查 第十三章 第二節(jié) 血小板止血作用及檢驗(yàn) 血小板粘附實(shí)驗(yàn) PAdT，玻珠柱法 原理 血小板粘附試驗(yàn)（ platelet adhension test，PAdT）利用血小板在體外可黏附于玻璃表面的原理設(shè)計(jì)，測(cè)定方法有多種，包括玻珠柱法、玻球法等。當(dāng)血液與一定表面積的玻璃接觸一定時(shí)間后，血小板粘附于玻璃表面，因此血液中