【正文】 ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術 (ATPTCA)的建立及其 臨床應用研究 碩士研究生：傅軍 導師：張偉 研究員 答辯提綱 ?第一部分： ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術概述 ?第二部分： ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術及質量 ? 標準的建立 ?第三部分： ATPTCA技術的臨床應用研究 第一部分 ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測 技術概述 研究背景 ? 化學治療是腫瘤的三大治療手段之一 。 近 30年來 ， 雖然某些惡性腫瘤的化學治療有明顯改善 ， 但多數(shù)腫瘤 ，特別是實體瘤療效仍不理想 。 這與腫瘤存在個體差異性 ，以及多重耐藥性等因素有關 。 ? 因此如何選擇有效藥物 ， 進行有的放矢的治療早已成為化療界所關注的問題 。 1. 主要的藥敏檢測方法及其 存在的問題 藥敏檢測方法 存在問題 集落形成法（ HTCA） 標本可評價率低，僅有 40~70％。 實驗周期長，需要 2周以上 測試藥物種類和數(shù)量有限 操作繁瑣，難以標準化 陽性預測值較低，僅有 40～ 60％ 四唑藍比色法 (MTT) 敏感性較差 ， 最低僅能檢測 500個細胞 量程較小 ， 有效量程在 細胞毒性差異染色法 (DiSC) 可適用標本類型不廣，目前僅用于血液腫瘤 人為判斷因素較大，難以推廣 標本可評價率不高，僅有 70～ 80％ 陽性預測值較低，僅有 70～ 80％ 胸腺嘧啶核苷摻入法 (3HTdR) 實驗人員接觸放射，不利于健康 標本可評價率不高，僅有 70～ 80％ 測試結果僅能反映少量處于增殖相的腫瘤細胞 對某些藥物的測試結果存在假陰性 理想的藥敏檢測方法應該 具備的條件 1. 操作簡便，可以標準化，便于推廣 2. 標本可評價率高 3. 檢測敏感、可靠、客觀 4. 具備產(chǎn)業(yè)化條件 2. ATP生物熒光藥敏檢測技術的優(yōu)點 : 敏感性好 可檢測最少 10個細胞。而其他技術則一般需要 500個細胞以上 可評價率高 標本可評價率在 90%以上 快速檢測 完成 ATP檢測僅需 30分鐘，而其它方法需 1～ 4小時的孵育時間 量程寬 檢測線性范圍為 10～ 100000個細胞 /孔（ 96孔培養(yǎng)板） 精密度好 變異系數(shù)（ CV） 小于 10%，在國家標準（ 10%）的范圍內(nèi) 結果準確 整體預測值為 86% 檢測效率高 同時動態(tài)檢測評估化療藥物 6個劑量下對腫瘤的殺傷作用 高通量檢測 適合 9 38 1536孔板檢測分析 自動化程度高 實驗數(shù)據(jù)計算機軟件自動分析，分析結果直觀可靠 穩(wěn)定性好 具備產(chǎn)業(yè)化條件 3. ATPTCA技術原理： 在有氧條件下 , 熒光酶 （ luciferase） 可以催化熒光素（ luciferin） 釋放出熒光 （ 波長為 562nm） ， 同時 ATP轉變成 AMP。 所釋放的熒光強度與胞內(nèi) ATP含量呈正相關 。細胞死亡后 ， 胞內(nèi) ATP迅速水解 ， 而活細胞的 ATP含量基本恒定 。 因此所測得的熒光強度反映了活細胞的數(shù)量 。比較藥物系列濃度對培養(yǎng)細胞的不同抑制率 ， 參照相應判斷指標 ， 從而可以評估該化療藥物對腫瘤細胞的殺傷效果 。 ATP + Luciferin + O2 ? AMP + 2Pi + Photons +Oxylaluciferin Luciferase 熒光強度與活細胞數(shù)量的關系 10010001000010000010000001000000010 20 40 80158 312 6251250 2500 500010000 20220 40000 80000細胞數(shù)量(個/孔）熒光強度(RLU)r＝ 流程 Tumor Single Cell suspension Mechanical and enzymatical dissociation Incubation for 57 days Addition of drugs/medium ATP Luminescence ATP extraction and stabilization Software Evaluation Construction of doseresponse plots 神經(jīng)母細胞瘤 黑色素瘤 甲狀腺癌 結直腸癌 乳腺癌 卵巢癌 胰腺癌 肉瘤 胃癌 肺癌 ?實體瘤標本 ?胸腹水 ?活檢淋巴結標本 7. 國內(nèi)外研究歷史回顧 1. 1982年 ， Moyer等首先提出內(nèi)源性 ATP的含量可以反映細胞活性 。隨后 Kangas等相繼證實生物熒光技術是一種敏感 、 可靠的確定各種細胞活性的檢測方法 。 2. 自 1988年 ， Sevin首先將此方法用于新鮮腫瘤組織的藥敏檢測 ， 在歐洲和美國已經(jīng)進行了大量的臨床應用研究 。 3. 1998年 ， Kurbacher等人報道了 ATPTCA輔助化療與傳統(tǒng)化療比較的臨床 Ⅱ 期試驗結果 ， 試驗結果表明 ， ATPTCA指導的化療治療復發(fā)性卵巢癌較傳統(tǒng)化療模式更能提高臨床療效 ， 延長病人總生存期和無進展生存期 。 4. NIH的 GOG (Gynecologic Oncology Group)項目組認為 ATPTCA是最有發(fā)展前途的一種藥敏試驗方法 ， 已納入重點科研項目 (1998)。 5. 至今該技術的臨床應用相關文獻已有 200余篇 。 6. 國內(nèi)尚無該技術產(chǎn)業(yè)化的報道 。 時間 國家 研究人 腫瘤類型 結論 1988年 美國 Sevin BU, Peng ZL 卵巢癌 陽性預測值： 92%，陰性預測值： 90% 整體預測精確值： 86% 1990年 日本 Jinushi K, Hirabayashi 胃癌 預測精確性為 % 1993年 瑞士 Koechli OR, Avner BP 乳腺癌 陽性預測值： 90%，陰性預測值： 86% 整體預測精確值： 85% 1995年 美、英、德三國協(xié)作 Andreotti PE Cree IA 順鉑耐受卵巢癌 整體預測精確值： 92% 1996年 英國 Cree IA, Kurbacher CM III/ IV期乳腺癌 整體預測精確值 ： 76