【正文】 1 第 11 章 組織工程相關(guān)納米生物材料 組織工程學(xué)（ Tissue Engineering）一門多學(xué)科交叉的邊緣學(xué)科，其研究涉及到細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物材料學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)相關(guān)學(xué)科。它是繼細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)之后，生命科學(xué)發(fā)展史上又一個(gè)新的里程碑，標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將走出器官移植的范疇，步入制造組織和器官的新時(shí)代，人們試圖通過組織工程學(xué)的研究，真正建造出替代人每一種組織甚至器官功能的生物性替代物。它的提出、建立和發(fā)展是對醫(yī)學(xué)領(lǐng)域組織、器官缺損和功能障礙傳統(tǒng)治療方法和模式的一次革 命，孕育著巨大的科學(xué)價(jià)值和廣闊的臨床應(yīng)用前景，是 21 世紀(jì)生命科學(xué)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一，必將產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟(jì)效益 【 1－ 2】 。 目前國內(nèi)外對組織工程學(xué)研究極為重視，組織工程相關(guān)產(chǎn)品正逐步形成高附加值的高科技產(chǎn)業(yè)，有些產(chǎn)品已開始進(jìn)入臨床。如人工皮膚 TransCyte、Apligraf、人工軟骨 CarticelTM等。其它領(lǐng)域如骨、膀胱、血管、角膜、神經(jīng)、輸尿管、肝、胰、心臟瓣膜、血細(xì)胞、食管、腸管等的研究也正處于積極的實(shí)驗(yàn)階段。 但是，目前組織工程研究尚存在許多基本問題亟待解決，主要表現(xiàn)在：①生命現(xiàn)象的本質(zhì)及活 動規(guī)律，即各種細(xì)胞、組織和器官的基本結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系；②如何調(diào)控種子細(xì)胞的特異性粘附、增殖、定向分化以使其獲得良好的生物學(xué)活性，充分發(fā)揮其特定的功能；③生長因子等組織誘導(dǎo)因子的大規(guī)模制備及持續(xù)控制釋放；④具有良好表面相容性、結(jié)構(gòu)相容性、適當(dāng)生物降解性和特定生物活性的仿生“智能”基質(zhì)材料的研制，以引發(fā)人們所需的特異性、可控性生物反應(yīng)等等 【 3－ 4】 。 納米科技給上述問題的解決帶來了新的發(fā)展機(jī)遇。和它在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中的意義與應(yīng)用前景一樣，納米科技在組織工程學(xué)各領(lǐng)域的研究中也有重大的科學(xué)意義及廣闊的應(yīng)用前景 ，人們可以將納米科技在其它領(lǐng)域的研究成果廣泛地應(yīng)用于組織工程學(xué)各相關(guān)領(lǐng)域 【 58】 。組織工程學(xué)和納米科技的有機(jī)結(jié)合，標(biāo)志著組織工程學(xué)研究進(jìn)入一個(gè)嶄新的時(shí)代 —— 納米組織工程學(xué)時(shí)代。納米組織工程學(xué)（ Nano tissue engineering）就是將納米科學(xué)與技術(shù)和組織工程學(xué)有機(jī)結(jié)合，從原子、分子水平認(rèn)識細(xì)胞和組織的基本結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)及活動規(guī)律，并研制具有特定功能的仿生納米裝置和材料，為更好地恢復(fù)、維持或改善病損組織的功能奠定基礎(chǔ) 【 1－ 4】 。 納米組織工程學(xué)的首要任務(wù)是利用納米科學(xué)的 原理和技術(shù)，從原子、分子水平進(jìn)一步深入認(rèn)識真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)及功能調(diào)控、基因產(chǎn)物如何構(gòu)建成細(xì)胞結(jié)構(gòu)、如何調(diào)節(jié)和行使細(xì)胞功能等，從而認(rèn)識各種細(xì)胞、組織和器官的基本結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)及活動規(guī)律。然后從科學(xué)認(rèn)識發(fā)展到工程技術(shù)，設(shè)計(jì)和制造出相應(yīng)的納米器件、納米藥物、納米仿生“智能”基質(zhì)材料， 2 如納米細(xì)胞監(jiān)測器、納米細(xì)胞清掃器、納米細(xì)胞修復(fù)器、納米細(xì)胞等，以更好地調(diào)控種子細(xì)胞的特異性粘附、增殖、定向分化等生物學(xué)行為，使其獲得良好的生物學(xué)活性，實(shí)現(xiàn)良好的功能替代。為最終解決目前組織工程學(xué)研究存在的 基本問題提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持 【 34】 。 在組織工程學(xué)研究中，細(xì)胞外基質(zhì)替代物即基質(zhì)材料的研究是一個(gè)至關(guān)重要的方面，是目前限制其發(fā)展和臨床應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。如何研制出具有良好表面相容性、結(jié)構(gòu)相容性、適當(dāng)生物降解性和特定生物活性的仿生“智能”基質(zhì)材料，以引發(fā)人們所需的特異性、可控性生物反應(yīng)，是目前組織工程學(xué)研究亟待解決的關(guān)鍵性基本問題之一 【 9－ 12】 。 因此，大力研究和開發(fā)新一代組織工程相關(guān)納米生物醫(yī)用材料，是新世紀(jì)生物醫(yī)用材料的重要發(fā)展方向，也是本章討論的重點(diǎn)。以下 就對組織工程相關(guān)納米生物材料的制備及表面仿生 修飾予以介紹。 納米纖維支架材料的制備 除可注射性材料以外 ,大多數(shù)組織工程支架必須預(yù)先制成多孔支架。組織工程多孔基質(zhì)材料應(yīng)具有功能梯度結(jié)構(gòu)，在三個(gè)尺度范圍控制著細(xì)胞的生長發(fā)育過程。從制備方法上看 , 解剖外形和尺寸（ mmcm）則取決于成型方法 ,而大孔尺寸(～ 102μ m)、孔壁尺寸 (～μ m)、孔壁內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu) (如微纖 ,微孔 ,50～ 500nm)取決于致孔方法。納米材料制備技術(shù)可以對基質(zhì)材料表面的納米結(jié)構(gòu) (nm)進(jìn)行設(shè)計(jì)和加工。納米材料中的維數(shù)概念與一般材料科學(xué)中的維數(shù)有所不同，納米材料根據(jù)維數(shù)的不同分為 三類： ① 零維材料指空間三維從尺度均為納米尺度的材料，如納米顆粒。 ② 一維材料指空間尺度有兩維處于納米尺度的材料，如納米棒。 ③ 二維材料指空間尺度有一維處于納米尺度的材料，如超薄層。 從多孔支架的孔形態(tài)上看，主要有纖維、多孔海綿 /泡沫、相連管狀結(jié)構(gòu)等三種 ,其中纖維支架是組織工程研究中最早采用的細(xì)胞外基質(zhì)替代物之一。在典型的結(jié)締組織中，結(jié)構(gòu)蛋白纖維，如膠原纖維和彈性蛋白纖維的直徑從幾十納米到幾百納米，這些納米級蛋白纖維相互交纏 ，形成非編織狀的網(wǎng)，為組織提供拉力和彈力。粘連蛋白，如纖維結(jié)合蛋白、層粘連蛋白為細(xì)胞的黏附提供特殊的結(jié)合位點(diǎn)。納米纖維支架有較高的表面與體積比，它可以大大增加細(xì)胞的黏附，從而可以增加細(xì)胞的遷移，增殖及分化功能。因此，納米纖維支架較傳統(tǒng)的支架更有發(fā)展前途 【 13－ 15】 ，也是本章討論的重點(diǎn)。 納米纖維支架材料的制備 有三種方法合成這種納米纖維支架材料：自組裝技術(shù)，電子紡絲技術(shù)，相分離技術(shù)。 1 自組裝技術(shù) 3 應(yīng)用分子自組裝技術(shù)，依靠分子間非共價(jià)鍵的鍵合作用制備超分子納米材料。在材料表面通過非共價(jià)鍵形 成自組裝膜，吸附分子存在時(shí)，局部形成的無序單層可以自我再生，生成更完善的有序體系，具有較大的流動性和可變形性，賦予適宜細(xì)胞生長的材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。用自組裝技術(shù)合成納米級超分子結(jié)構(gòu)，也可合成納米纖維 【 15】 。 為了模擬形成 天 然骨的納米結(jié)構(gòu) , Stupp等 【 16－ 19】 應(yīng)用 pH控制的自組裝技術(shù)設(shè)計(jì)合成了一種 兩親性多肽（ PA） , 可以自組裝生成納米結(jié)構(gòu)纖維支架 。 這種圓錐形的 兩親性多肽主 要包括 5 個(gè)基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征 : (1) 長的疏水烴基尾端 。 (2) 含有 4個(gè)連續(xù)的半胱氨酸殘基，通過氧化反應(yīng)，半胱氨酸上的 SH基 團(tuán)可與另外一條多肽鏈上 SH自組裝 形成二硫鍵，從而使多肽鏈形成牢固的高級結(jié)構(gòu) 。 (3) 含三個(gè)甘氨酸的交連部分，以提供親水性的頭基與堅(jiān)硬的交聯(lián)區(qū)域的結(jié)合 。 (4) 磷酸化的絲氨酸位點(diǎn)，這些位點(diǎn)帶有大量負(fù)電荷，可以誘導(dǎo)鈣離子沉積、成核生長并自組裝而成納米晶 HA。 (5) 含有細(xì)胞結(jié)合配體序列 Arg－ Gly－ A sp（ RGD），可促進(jìn)種子細(xì)胞的黏附 。 其中，半胱氨酸，磷酸纖維化的絲氨酸以及 RGD序列是 PA肽鏈的特征性結(jié)構(gòu)（圖 11－ 1）。 由于 PAs有圓錐狀結(jié)構(gòu)和兩性分子的特點(diǎn)，可以自組裝形成圓柱狀納米纖維 , 納米纖 維直徑約為 ，長度超過 1181。m（圖 11－ 2）。在結(jié)構(gòu)方面，兩親性多肽 鏈與納米纖維垂直， 疏水端包裹在長柱狀結(jié)構(gòu) 內(nèi)部，親水端 暴露在長柱狀結(jié)構(gòu)的 表面。這與天然膠原基質(zhì)有所不同，在天然膠原中其排列呈平行狀。在 pH=8時(shí)將二硫蘇糖醇注入 PAs，然后調(diào)整 pH=4，酸化的 PAs很快自組裝交聯(lián)固化而形成納米纖維。 這種離散型納米纖維能通過氧化生成二硫鍵發(fā)生交聯(lián)達(dá)到材料的自組裝 , 同時(shí)也能通過自由巰基的釋放來控制自組裝的可逆過程 。 生成的 納米纖維可 相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) , 宏觀呈凝膠狀。研究表明 , 提供足夠量的酸性磷酸化絲 氨酸和天門冬氨酸能促進(jìn)初始 HA 的成核 , 將此凝膠浸入鈣磷酸鹽緩沖溶液中 ,表面充滿帶負(fù)電荷 酸性氨基酸的 納米纖維可通過建立局部的過飽和離子環(huán)境促進(jìn)自身礦化生成納米 HA晶體 , 這些礦化的納米纖維中 Ca/P比率為 177。 , 而且晶體學(xué)上的 HA c 軸沿膠原纖維長軸定向排列 , 類似與自然骨最基本的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。 4 圖 111兩親性多肽（ PA） 圖 112兩親性多肽自組裝形成圓柱狀納米纖維 , 納米纖維直徑約為 。 5 膠原是一種三股螺旋超二級結(jié)構(gòu)，它由三條左旋的多肽鏈組成。 Fields 等用一種兩親性多肽（ PA）分子去模擬這種結(jié)構(gòu)。 PA 由 a1(IV)12631277 膠原序列 GlyValGlyAspLysAsnProGlyTrpProGlyAlaPro（ IVHI）結(jié)合一個(gè)長鏈單或雙羥基脂質(zhì)（ 14－ 18）組成。膠原序列的頭端組成了三維螺旋結(jié)構(gòu)，而親脂的尾部與疏水端相結(jié)合以誘發(fā)和穩(wěn)定膠原序列頭端的三維結(jié)構(gòu)，并且因它的長度和分支不同而影響 PA 超分子結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。在生理?xiàng)l件下，（ IVHI）PAs 可以自組裝成三股螺旋狀結(jié)構(gòu)。在（ IVHI） PA 中培養(yǎng)黑色素瘤 細(xì)胞，以檢測與細(xì)胞黏附，展開及信號傳導(dǎo)有關(guān)的生物學(xué)特性。發(fā)現(xiàn) PA 能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞黏附。細(xì)胞的展開在 50％ molar 的（ IVHI） PA 雙分子層及（ C18） 2GluC2COOH3親水分子面明顯增加。這種三股螺旋構(gòu)象的穩(wěn)定性可以影響細(xì)胞的黏附及展開 【 20－ 21】 。 在酸性分泌蛋白序列的基礎(chǔ)上研發(fā)了嵌合體 PA。特點(diǎn)是其富含半胱氨酸，即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白（ SPARC）。其能促進(jìn)細(xì)胞增殖及血管發(fā)生。上皮細(xì)胞被用來檢測 SPARC PA 的生物活性。 SPARC PA 自身能輕微地促進(jìn)細(xì)胞的黏附和伸展，當(dāng)它與 C10－ （ a1(I)496507）混合時(shí)，它可以明顯地促進(jìn)細(xì)胞黏附和展開，其水平相當(dāng)于 I型膠原。 2 電子紡絲技術(shù) 【 22】 電子紡絲 技術(shù)是通過在聚合體溶液 /融液中加入電荷懸浮微粒而制成超細(xì)的納米纖維。 1934 年 Formhals 首先申請了 電子紡絲 技術(shù)的專利。其原理是利用電流使得聚合體溶解 /融化，再由收集器收集，聚合體溶液 /融液要在收集器中固化，在收集器的頂端通過重力或機(jī)械泵產(chǎn)生懸浮微粒，用（ 10－ 20KV）的高電壓產(chǎn)生足夠的靜電荷，當(dāng)靜電荷克服了微粒的表面張力后聚合體溶液 /融液就噴出了。隨著溶劑的蒸發(fā)，表面電荷 密度增加，噴射流越來越細(xì)，納米纖維雛形形成。在噴射物干燥的過程中，噴射物中靜電荷的放射狀力量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于噴射物中的內(nèi)聚力，這些導(dǎo)致聚合物擴(kuò)展或分解成直徑相同的小的噴射物和電位電荷，這些小的噴射物最終在金屬樣本收集器上形成納米纖維 【 23－ 24】 。 在 電子紡絲 技術(shù)中尋找合適的溶劑相當(dāng)困難。 HFP是靜電纖維纏繞技術(shù)中溶解蛋白質(zhì)的常用溶劑。溶解絲蛋白用甲醇作溶劑。靜電纖維纏繞技術(shù)中絲蛋白可以在水中與 PEO混合，然后用甲醇洗滌，除去 PEO。 Huang 等用基因工程的方法合成一 條含 多次 重復(fù) 的彈 力蛋 白多 肽鏈 ，（ ValProGlyValGly ）4(ValProGlyLysGly)。這條多肽溶解在水中，在適當(dāng)條件下用靜電纖維纏繞技術(shù)合成直徑 200－ 300nm 的納米纖維。 Fang 報(bào)道用小牛胸腺鈉－ DNA 水溶液合 6 成直徑 50－ 80 nm 的納米纖維 【 25】 。 目前 ,利用電子紡絲技術(shù) 開發(fā) 生物醫(yī)用材料制品已成為研究的熱點(diǎn)。研究的方向主要集中在兩方面 :一是利用電子紡絲制備的納米級纖維 ,作為細(xì)胞支架、藥物等添加劑的載以及納米級仿生材料等。二是改變收集方法以獲得薄膜及管狀物等功能性形態(tài)結(jié)構(gòu) ,可廣泛用于傷口包覆材料、功能性膜、人造導(dǎo)管等 【 26－ 27】 。 現(xiàn)在組織工程中廣泛應(yīng)用的生物材料多是由 電子紡絲 技術(shù)制成的納米纖維。典型的生物可降解聚合物 PLGA或 PCL,水溶性生物材料如 PEO、 PVA用水或有機(jī)溶劑很容易被 電子紡絲 法制成納米纖維， PLGA及 PCL纖維的直徑分別為 500－ 800nm及200－ 600nm， PLGA無紡三維多孔支架的孔隙率 90%（ 圖 11－ 3）。Ⅰ型膠原纖維的平均直徑 250nm，天然的聚合體，如：膠原，絲蛋白，彈力蛋白衍生肽，纖維蛋白原，酪蛋白及脂肪酶甚至 DNA都可以用 電子紡絲 技術(shù)處理，生成納米纖維。一個(gè)有趣的現(xiàn)象是靜電纖維 纏繞技術(shù)生成的Ⅰ型膠原納米纖維的 67－ nm現(xiàn)色帶為典型的天然膠原纖維。 Fang等 【 28】 用 1mg 的小牛胸腺 Na DNA 溶液 (濃度 – %),通過電子紡絲制備了 50 80nm納米纖維。 圖 113 電子紡絲 法制備的 PLGA納米纖維，直徑為 500－ 800nm，孔隙率 90%。 7 從生物學(xué)角度看 ,人體幾乎所有器官 (如骨、牙周組織、膠原、皮膚、軟骨等 ) 都是以納米級纖維形式存在。許多報(bào)道，認(rèn)為電子紡絲制備的納米纖維膜能夠支持細(xì)胞粘附和增殖 ,接種在纖維膜上的細(xì)胞保持表型并按納米纖 維取向引導(dǎo)生長。電子紡絲制備的納米纖維支架與常規(guī)纖維支架相比 ,納米纖維支架與細(xì)胞外基質(zhì)在形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有更高的相似性，在纖維支架中纖維直徑小于細(xì)胞直徑有利于細(xì)胞粘附和生長。納米纖維支架特有的高比表面積和孔隙率 ,有利于細(xì)胞接種、遷移和增殖 ,并有好的生物相容性 ,達(dá)到了細(xì)胞支架的設(shè)計(jì)要求 【 29】 。 最近 ,Jin等 【 30】 將人骨髓干細(xì)胞 (hBMSCs) 種植在由絲素和 PEO(聚氧乙烯 ) 共混后電子紡絲制備的纖維支架上。培養(yǎng) 10 天后 ,用 SEM和 MTT觀測后發(fā)現(xiàn) ,納米纖維膜促進(jìn)了細(xì)胞粘附和增殖。 Yos