【正文】 m）細(xì)胞在其表面的生長速率要比孔徑大時 （ 如 10181。表面微紋結(jié)構(gòu)基體上的細(xì)胞堿 性磷酸酶 (ALP) 活性明顯高于表面光滑基體上的細(xì)胞 ,這表明表面微紋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞生長有一定促進作用 [7 ] 。 生物材料表面的微結(jié)構(gòu)域可以調(diào)控細(xì)胞與基質(zhì)的信號傳導(dǎo) ,從而影響細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)域的形成和細(xì)胞骨架的發(fā)育 ,最終形成具有高度取向的細(xì)胞圖案。鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明 , 在面積為 10000181。很多文獻報道了材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對細(xì)胞的鋪展、取向及遷移的影響。m 的溝槽。 但相對而言 ， 凹槽深度對細(xì)胞的定向生長的影響要大于凹槽寬度的影響 ； 通常隨著凹槽深度加深 ， 它對細(xì)胞的定向生長的影響也變大 ， 但隨著凹槽寬度加寬 ， 其對細(xì)胞的定向生長的影響卻變小 。 不同的粗糙程度及不同的表層微觀形貌結(jié)構(gòu)如凹槽型 、 山脊型 、 孔洞型等對細(xì)胞的粘附 、 定向生長 、 遷移都有直接不同的影響 。 Shirato等 【 88】 在鼠腎小球基底膜上觀察到網(wǎng)篩 (meshwork) 結(jié)構(gòu) , 內(nèi)層由 5～ 9nm 厚的原纖維和 11～ 30nm寬的孔組成。早在 20世紀(jì) 40年代 , 就有學(xué)者提出“接觸引導(dǎo)”(contact guidance) 的概念 , 70 年代開始研究納米結(jié)構(gòu)特征對細(xì)胞行為的影響。 Mikos等采用聚 (反丁烯二酸丙二醇 co乙二醇 ) 共聚合 ,丙烯酰化聚乙二醇和丙烯?；?25 乙二醇 生物素 (或多肽 ) 在過硫酸銨存在下交聯(lián)制得了偶聯(lián)有 生物素 (或多肽 ) 的水凝膠 ,并證實可通過控制 PEG鏈段的長度、 PEG在聚合物中的比例和 PPFPEG的分子量 ,控制生物素 (或多肽 ) 在凝膠表面的含量。 水凝膠體系由于具有高親水性 ,與軟組織的類似性 ,能為細(xì)胞和生物活性因子提供溫和的生存環(huán)境 ,在負(fù)載 RGD等生物因子方面具有更潛在的應(yīng)用價值?？梢岳镁酆衔镏邪被?、雙羥基鍵合蛋白和多肽 (RGD , 生長因子 ) ,這種具有反應(yīng)活性的聚合物既可用作多孔的組織工程支架 ,也可用作藥物緩釋材料。共聚物在 Pd/C 作用下脫去保護 ,溶液澆鑄成膜 ,或先成膜 ,在堿性條件下水解脫去保護基團 ,使其表面為羧基 ,可以通過偶聯(lián)劑二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC) 將小肽序列精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 絲氨酸 (RGDS) 接枝到 COOH 上。 24 采用蘋果酸和乙醇酸制成的交酯 BMD均聚或共聚，可以在聚合物側(cè)鏈引入功能基團，形成含 RGD肽鏈的雜化聚合物。結(jié)果顯示 , 通過調(diào)整 PEG鏈段的長度 ,可以控制調(diào)整聚合物中氨基密度和分布 ,為調(diào)整多肽的密度和分布創(chuàng)造了條件。結(jié)果表明 ,修飾膜明顯改進了聚乳酸的細(xì)胞親和性 ,促進了成骨細(xì)胞的黏附、增殖及堿性磷酸酶活性的表達(dá)。 在硬組織工程 研究中 ,磷酸鈣表面修飾的生物陶瓷和可植入金屬以其良好的生物相容性和骨整合性能 ,越來越多地應(yīng)用于牙和骨修復(fù)。 將肽固定在材料表面可由于空間 阻礙而降低肽的活性。 研究發(fā)現(xiàn)， RGD組裝成的納米尺度的團簇結(jié)構(gòu)比無 規(guī)肽結(jié)構(gòu)更能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞的黏附和移動 ,所以修飾材料表面的 RGD 密度也要適宜。PLLGRGDS可結(jié)合到 PLA 表面 【 75】 。 多肽需通過適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑才能固定在生物材料表面。 所以將多肽 － 白蛋白復(fù)合物吸附在材料表面 , 對材料進行表面改性。化學(xué)方法是在聚合物表面通過改變其化學(xué)結(jié)構(gòu) ,如通過聚合物表面水解、等離子沉降、紫外輻照、自組裝、模板技術(shù)等在聚合物表面引入能夠與生物活性物質(zhì)鍵合的功能基團如 OH , COOH ,NH2 等 ,從而鍵合 RGD。表面修飾法可分為物理方法和化學(xué)方法兩大類。 22 多肽固定在材料表面通 過兩種方式 : 共價鍵和非共價作用。而對含有易被水解的酯基的聚合物如PMMA、 PET、 PLA,可以在堿溶液中部分水解使其表面產(chǎn)生羧基。 Chen 等使用40keV 碳正離子注入對聚羥基鏈烷酸酯膜改性 ,親水性得到改善 ,培養(yǎng)成纖維細(xì)胞 ,發(fā)現(xiàn)基體膜的細(xì)胞相容性明顯提高 ,細(xì)胞 黏附形態(tài)的變化估計和表面改性時發(fā)生的物理化學(xué)過程有關(guān)。 7 離子注入技術(shù) 離子注入是將帶電離子高能射入到固體表面 ,與固體內(nèi)原子核及核外電子云發(fā)生相互作用 ,同時在以離子經(jīng)過的軌跡外層一定半徑范 圍內(nèi)使得固體中原有分子和原子發(fā)生激發(fā)、電離等復(fù)雜行為 ,引起表面化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明 ,固定有 RGD 的材料可以有效的促進成骨細(xì)胞的黏附和分化。但是 ,等離子體改性也有其缺點 :如等離子體可能在生物材料表面濺射、刻蝕使材料表面形貌發(fā)生變化 。 (2) 不需向反應(yīng)體系提供能量用于激發(fā)產(chǎn)生自由基。 (2) 聚合物分子鏈上激發(fā)產(chǎn)生自由基 。 Zhu 等采用紫外光氧化接枝的方法將親水性聚甲基丙烯酸 (PMAA) 接枝到聚己內(nèi)酯 (PCL) 表面 ,用水溶性碳二亞胺 (EDC) 作為偶聯(lián)劑在接枝膜表面固定了明膠 ,經(jīng)過改性后的 PCL 膜表面的親水性顯著提高 ,內(nèi)皮細(xì)胞在改性 PCL 膜表面上培養(yǎng) 96h 后的細(xì)胞增殖率和活性均有明顯提高。光化學(xué)固定法由以下三個步驟組成 : ①將光反應(yīng)劑被覆在材料表面 。紫外光接枝是適合表面改性的有效方法 ,它具有以下優(yōu)點 : (1) 紫外光比高能輻射對材料的穿透力差 ,故接技聚合可嚴(yán)格地限定在材料的表面或亞表面進行 ,改性反應(yīng)僅發(fā)生在表面 50～ 100nm 深度內(nèi) ,不會損壞材料的本體性能 。 高能輻照會改變材料表面微觀結(jié)構(gòu) ,導(dǎo)致拓?fù)湫蚊病駶櫺院蜕锵嗳菪缘淖兓? 4 高能輻射法 高分子材料表面輻射改性的放射線源有γ射線 (60Co) 、β射線 (85 Kr) 、α射線 (210 Po) 及 X 射線和電子射線等。 Cui 等采用氫氧化鈉溶液表面水解聚乳酸 (PLA) ,水溶性碳二亞胺 (EDC/ NHS) 活化表面羧基 ,共價鍵合殼聚糖 (CS) 分子 ,提高了材料表面的親和性 ,在其表面培養(yǎng)牛軟骨細(xì)胞 ,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性和增殖率均比未改性 PLLA 顯著提高。 ②將帶反應(yīng)性功能團單體通過聚合反應(yīng)接枝到聚合物表面。表面化學(xué)接枝一般僅限于材料表面發(fā)生的非均相反應(yīng)。它克服了物理吸附中生物活性分子不能長期 作用于材料表面、易脫落的缺點。 Zhu 等先將聚乳酸 (PLA) 膜浸泡在 溶解了海藻酸鈉和氨基酸衍生物接枝產(chǎn)物的水 / 丙酮 ( V (水 ) / V (丙酮 ) = 70/ 30) 溶液中 ,再轉(zhuǎn)移到 CaCl2 溶液中 ,在 PDLLA 表面形成不溶于水的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。加入改性組分 (常溶解在非溶劑相中 ) ,其鏈段通過分子運動可進入高聚物表面鏈段之間。在對吸附質(zhì)量要求不高的領(lǐng)域 ,仍有其一定的應(yīng)用價值。組織工程用生物材料作為植入材料 ,使用時主要考慮其生物相容性 ,即材料表面與宿主 間界面上的相互作用 ,因此對植入材料的改性主要是對其表面的修飾。 這已成為材料表面修飾促進細(xì)胞黏附的一個重要措施。羧基、磺酸基、胺基、亞胺基及酰胺基等基團則可促進細(xì)胞的黏附和增殖。通過固定含有豐富帶正電基團的氨基酸 (如賴氨酸 ) 在材料表面 ,可以提高材料的表面電荷濃度 ,增加黏附細(xì)胞的 數(shù)量和增強細(xì)胞的黏附力。同時 ,材料表面的粗糙度與材料的表面能大小具有密切關(guān)系 ,隨著表面粗糙度的提高 ,材料表面非極性組分的表面能顯著增大。蛋白質(zhì)與生物材料表面接觸和吸附過程中 ,常伴隨水 / 蛋白質(zhì)的吸附交換 ,而異種蛋白質(zhì)間的吸附交換常有 Vroman 效應(yīng)產(chǎn)生。研究表明 ,不同細(xì)胞在具有不同粗糙度的材料表面的黏附行為有很大差異。 3 材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 生物材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)無論在生物相容性還是在人工 ECM 中都起著重要作用。 因此 ,設(shè)計具有特定功能的蛋白質(zhì)或其多肽片段及誘導(dǎo)已有蛋白質(zhì)功能的演變是探索、模仿細(xì)胞識別的兩條途徑。 2 生物材料表面的生物特異性識別 生物材料植入體內(nèi)后一般會產(chǎn)生非特異性和特異性相互作用 , 細(xì)胞識別功能是宿主產(chǎn)生移植排斥的根本 原因。 黏著斑黏附 (focal adhesion) 是細(xì)胞與基質(zhì)黏附接觸的常見形式?；|(zhì)表面性質(zhì)對細(xì)胞響應(yīng)可借助于吸附過程介導(dǎo) ,該過程涉及不同來源的許多化合物間的競爭。 在組織工程中 ,組織工程用支架植入體內(nèi)后 ,生體內(nèi)的細(xì)胞受體積極在支架表面搜尋配體 ,以期得到響應(yīng)。當(dāng)植入材料生物體系統(tǒng)的非特異性吸附作用被完全抑制 ,同時又具備細(xì)胞識別的相應(yīng)位點 ,則會被細(xì)胞認(rèn)為是自體 ,實現(xiàn)材料和細(xì)胞的融合作用 ,積極誘導(dǎo)組織再生。當(dāng)材料植入體內(nèi) ,細(xì)胞膜表面的受體積極尋找與之接觸的材料表面所能提供的信號 ,以區(qū)別所接觸材料為自體或異體 ,因此深入理解生物材料表面與細(xì)胞相互作用并進行表面修飾是臨床應(yīng)用材料設(shè)計的關(guān)鍵。 所以深入研究仿生工程化生物材料表面與細(xì)胞間的相互作用，并對生物材料進行表面修飾 ,使其具備良好的生物相容性及能使細(xì)胞和分子產(chǎn)生響應(yīng)的特異性識別位點 ,是設(shè)計和改進第三代生物材料的關(guān)鍵，也是當(dāng)前研究的熱點。血漿、紫外線、 r射線、高溫或基本環(huán)境的破壞都很容易破壞納米纖維，一些表面修飾方法，如涂層，表面靜電作用，在適當(dāng)?shù)臈l件下可以固定活性分子在聚合體的表面，以抵抗納米纖維抵御外界環(huán)境變化的能力。 Wang 等 【 59】 將熒光聚合體與聚氨酯乳膠混合，將混合物制成納米纖維膜，該膜具有高度敏感的光學(xué)探測功能，用于檢測金屬離子（ Fe3+和 Hg2+）和 2，4－二硝基甲苯 (DNT) 納米纖維的表面修飾：合成生物材料的表面修飾是為了提高其生物相容性。 納米纖維的本體修飾：聚合體納米纖維通過混入其他分子而改變其功能。 納米纖維的修飾 在體內(nèi)環(huán)境中，細(xì)胞和材料的相互 作用實際上是細(xì)胞膜表面的受體與生物材料表面所能提供的相應(yīng)配體之間的分子識別。 來自天然原料的納米纖維通常比合成聚合物納米纖維有更好的細(xì)胞間相互作用。將成人 來源的脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞在 PCL 納米纖維支架中培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)化生長因子 B1（ TGFB1）存在下可以誘導(dǎo)生成軟骨細(xì)胞，可以通過軟骨特有的基因表達(dá)和合成軟骨相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)（ ECM）蛋白證實。嵌段共聚物納米纖維基質(zhì)可以促進內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的黏附和增殖。美國曾專利報道，通過一個輔助 13 的電場，圍繞縱 軸旋轉(zhuǎn)的收集管可以制備同心圓方向的定向排列的納米纖維，由此獲得的小直徑管道結(jié)構(gòu)納米纖維基質(zhì)，可作為血管，泌尿道及膽道修復(fù)假體。 Zong 等 【 45】 用柱形法制備定向排列的聚合體納米纖維，用 電子紡絲 技術(shù)，從抗拉力伸展器中按一定的速率拉出無紡的網(wǎng)狀纖維，隨后在拉緊狀態(tài)下在幾個不同的溫度下（ 60℃－ 90℃）退火。通過使用一個邊緣銳利的旋轉(zhuǎn)盤作為收集器， Ma PX 等制備了定向排列的PLLAcoPCL 納米纖維，已成功地被用來指導(dǎo)細(xì)胞的排列。另外，在韌帶組織中，成纖維細(xì)胞的排列方向與韌帶的方向一致，可以增強組織的牽拉力。 Ma PX 等用調(diào)整聚合體濃度和溶劑導(dǎo)電率的方法獲得直徑10nm 的 PLLAcoPCL 納 米纖維。納米纖維的直徑從幾十到 300納米不等，人們一直渴望獲得天然 ECM中蛋白纖維的直徑，換句話說，在人造的基底膜中，需要制造小直徑纖維（從幾 到幾十納米）來模擬Ⅳ型膠原及層粘連蛋白。納米纖維支架通過滲入可以完全控制相互關(guān)聯(lián)的孔狀結(jié)構(gòu)，模擬天然膠原的三維立體結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用相分離技術(shù)制成的納米纖維支架，其多樣性更豐富也更容易控制?！柏?fù)”支架的構(gòu)建既可手工完成 ,也可用快速成型技術(shù)來實現(xiàn)自動化。親水性水凝膠多孔支架在體液環(huán)境中強度下降是一個值得重視的問題 ,一般需要與其它材料復(fù)合。支架孔隙率 90～ 95 % ,大孔尺寸達(dá) 200μ m ,溶劑揮發(fā)還會形成 m 以下的微孔 ,孔表面積達(dá) 58～ 102m2/g,為相連的孔結(jié)構(gòu)。同時 ， Ma等 【 40】 比較了相同孔隙率的納米纖維支架和泡沫狀 PLLA支架，研究發(fā)現(xiàn)：納米纖維支架大約吸收 4倍的人血清蛋白，還可以優(yōu)先地吸收細(xì)胞黏附蛋白，如：纖維結(jié)合蛋白和玻璃體結(jié)合蛋白，比泡沫狀 PLLA支架大約高出 2－ 4倍，納米纖維支架中成骨細(xì)胞的黏附是泡沫狀 PLLA支架的 2倍。這樣的支架能夠為細(xì)胞粘附生長提供一個更大的空間。 ③將凝膠浸入蒸餾水中進行溶劑置換 。低溫下凝膠化可形成納米級的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 9 圖 114 相分離技術(shù)制備的 PLLA納米纖維 支 架。因而 ,相分離法又往往稱為冷凍干燥法 。與溶液噴絲法制備無紡布纖維支架相比 , 用電子紡絲法制備納米纖維需要 高電壓操作 , 加工成型比較困難 , 制備的無紡布比較薄 , 力學(xué)性能不很理想。近來 ,Matthews【 34】 在用電子紡絲法研 究膠原作為細(xì)胞支架的可行性 ,用凍干的雞胸軟骨Ⅱ型膠原電子紡絲后獲得了 110nm～ 1. 8μ m 的纖維 ,并將軟骨細(xì)胞種植在這種纖維支架上。近來 Dubson利用電子紡絲技術(shù) ,用聚氨酯、聚四氟乙烯等原料 ,采用不同收集方法和工藝參數(shù)獲得的復(fù)層人造血管柔順性好 ,孔隙率高 ,力學(xué)性能優(yōu)良。另外 ,這種結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞釋放 ,細(xì)胞活性沒有受到影響。 傳統(tǒng)的膜材料由于存在難以控制孔隙率 ,浸在液氮中易變脆和難以保持完整性等缺點 ,限制了其作為細(xì)胞儲存和運輸載體材料的應(yīng)用。用 SEM觀察并進行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)測試。納米纖維支架特有的高比表面積和孔隙率 ,有利于細(xì)胞接種、遷移和增殖 ,并有好的生物相容性 ,達(dá)到了細(xì)胞支架的設(shè)計要求 【 29】 。 圖 113 電子紡絲 法制備的 PLGA納米纖維，直徑為 500－ 800nm，孔隙率 90%。典型的生物可降解聚合物 PLGA或 PCL,水溶性生物材