【正文】 生物制藥信息 2020 年 02 月 ● 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與制藥 ■細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法 ■ 國內(nèi)外動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)研發(fā)概述 ■動(dòng) 物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及其生物反應(yīng)器工程平臺(tái) ■ 無 血清培養(yǎng)基研制及細(xì)胞馴化技術(shù) ■ 動(dòng)物細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)工藝 ● 疫苗行業(yè)信息 ◆ 疫苗產(chǎn)業(yè)新增長趨勢分析 ◆ 動(dòng)物疫苗市場將進(jìn)入黃金時(shí)期 ◆ 全球疫苗市場壟斷加劇 ◆ 狂犬病疫苗為何加價(jià) 100%？ ◆ DNA 疫苗欲做抗擊流感的急先鋒 ◆ H5N1 禽流感病毒破解有新法 ◆ 阿爾茨海默癥疫苗可望上市 ◆ 國內(nèi)首 個(gè)四聯(lián)疫苗誕生 ◆ 一種新高效乙肝疫苗免疫增效劑發(fā)現(xiàn) ◆ 河南省成功研制國內(nèi)首個(gè)禽流感（ H9） 三聯(lián)滅活疫苗 ◆ 抗擊宮頸癌的新疫苗 ◆ 狂犬疫苗將成為強(qiáng)制免疫疫苗 ◆ 體外成功培養(yǎng) C 型肝炎病毒 ◆ 輪狀病毒疫苗研究贏得認(rèn)可 ◆ 美抗禽流感 DNA 疫苗首次進(jìn)入人體試驗(yàn) ◆ 我國構(gòu)建成功新型多表位人工抗原瘧疾疫苗 ◆ 乙肝疫苗療法不能取代藥物 ◆ 中國“禽流感”人用疫苗株研發(fā)成功 ◆ 三公司獲美國政府流感疫苗研究合約 ◆ 中牧 7000 萬元建成寵物疫苗生產(chǎn)基地 ● 基因診斷和基因治療 ? 基因改造細(xì)胞幫助皮膚重建與防御病菌 ? 將基因沉默理論用于硬 皮病 ? 基因診斷疾病，正走近我們的生活 ? 日本開發(fā)出禽流感病毒快速檢測法 ? 首例遺傳性腎炎產(chǎn)前基因診斷成功 ? 英國基因研究小組接近突破癌癥的邊緣 ? 體外診斷產(chǎn)業(yè)蓄勢待發(fā) ? 基因檢測診病：一個(gè)高科技神話 ? 美科學(xué)家用新方法激活基因 ? 全球癌癥權(quán)威訪港發(fā)表演說抗癌藥研究有重 大進(jìn)展 ● 重組蛋白藥物和抗體藥物 ★德國發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致甲型流感病毒致命性的蛋白 ★抗過敏新藥的發(fā)展劍橋抗體技術(shù) ★ 研究人員新發(fā)現(xiàn)能控制睡眠的化學(xué)物質(zhì) ★昆明動(dòng)物所建立“抗 HIV 藥物研發(fā)技術(shù)平臺(tái)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室” ★擴(kuò)散性乳腺癌的選擇性標(biāo)記蛋白 ★世界第一個(gè)動(dòng)物 乳腺生物反應(yīng)器重組蛋白藥物獲準(zhǔn)上市 ★中國和英國科學(xué)家聯(lián)手抗擊新發(fā)傳染病 ★單克隆抗體 — 高增長生物導(dǎo)彈 ★抗癌藥物會(huì)危害骨骼 ★動(dòng)力蛋白在神經(jīng)元連接中發(fā)揮重要的作用 ● 其它信息 ■北京推出新型流感病毒檢測試劑盒 ■全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)回顧與展望 ■人類 H5N1 病毒復(fù)制速度持續(xù)增加 ■生物制藥板塊春天將至投資良機(jī)噴出 ■中國 2020 年成為生物技術(shù)強(qiáng)國和產(chǎn)業(yè)大國 ■ 131lchTNT 為晚期肺癌治療提供新選擇 ■ STRA6 蛋白質(zhì)幫助維生素Ａ進(jìn)入細(xì)胞的“分子鎖” ■ 新藥研發(fā)中的兩個(gè)觀念轉(zhuǎn)變 生物制藥信息匯編 清大天一生物 第 1頁 ◆ 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與 制藥 細(xì)胞培養(yǎng)基的使用方法 清大天一 羅海春 細(xì)胞培養(yǎng)基的種類繁多，細(xì)胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及最大程度地保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)以維持細(xì)胞的生長，對(duì)每個(gè) 細(xì)胞 培養(yǎng) 工作 者都很重要。培養(yǎng)基的使用依 據(jù) 不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細(xì)胞種類的不同而存在差異。 1 細(xì)胞培養(yǎng)液的構(gòu)成 細(xì)胞培養(yǎng)液指細(xì)胞生長的液體環(huán)境，一般指完全培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。 細(xì)胞培養(yǎng)基 amp。血清模式 血清對(duì)于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長和增殖的大多數(shù)細(xì)胞系來說是需要的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)單獨(dú)的培養(yǎng)基并不 能提供細(xì)胞生長所需要的全部營養(yǎng)，如 MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為 5%～ 10%的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至 3%左右，細(xì)胞的形態(tài)和功能不受影響。 圖 1 BHK2113第 14代， MEM SLM培養(yǎng)基（ SLM120） +3%NBS， 100 注： SLM120為清大天一公司低血清培養(yǎng)基，左為培養(yǎng) 24小時(shí)細(xì)胞密度，右為 48小時(shí)細(xì)胞密度。 血清可在培養(yǎng)基滅菌后加入，也可與培養(yǎng)基混合后一起 過濾。血清的添加一方面補(bǔ)充了細(xì)胞生長、增殖所需的一些因子（如生長因子等），另一方面也增加了培養(yǎng)基的黏滯度，這樣可以降低細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中或被胰蛋白酶消化后的損傷。 但是血清的加入也帶來了很多問題，血清都是批量生產(chǎn)，各批 之間差異很大，血清含一些對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶、補(bǔ)體、抗體、細(xì)菌毒素等都會(huì)影響細(xì)胞生長，甚至造成細(xì)胞死亡。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。血清質(zhì)量問題還會(huì)對(duì)接種病毒以及毒價(jià)產(chǎn)生影響，例產(chǎn)毒少，毒價(jià)低。 細(xì) 胞培養(yǎng)基 amp。乳歐液模式 化學(xué)合成培養(yǎng)基現(xiàn)雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領(lǐng)域水解乳蛋白（ Lactalbumin Hydrolysate ）仍在使用，以補(bǔ)充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質(zhì)。較為常用的方式是用漢氏（ Hanks’ BSS）或歐式 (Earle’ s BSS)平衡鹽溶液溶解水解乳蛋白（一般為 5‰ 濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學(xué)合成培養(yǎng)基（一般為 MEM）按比例混合使用（如 1： 1）。 水解乳蛋白為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸。既可用于細(xì)菌微生物培養(yǎng)，又可用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中一般為 %水解乳蛋白（經(jīng)平衡鹽溶解）與合成培養(yǎng)基（如 MEM）按 1:1混合使用。目前在生產(chǎn)中主要用于地 鼠腎細(xì)胞等細(xì)胞的培養(yǎng)和維持。但是水解乳蛋白的使用也給生物制品的生產(chǎn)帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)。首先由于水解乳蛋白來源于動(dòng)物，有可能攜帶傳染源，包括病毒和有毒物質(zhì)。任何一種傳染源都可能對(duì)正在生長的細(xì)胞系或者制品帶來風(fēng)險(xiǎn)。其次水解乳蛋白及含有動(dòng)物組分培養(yǎng)基的使用，使生物制品下游處理變得復(fù)雜，這對(duì)于蛋白質(zhì)藥物顯得更加重要。因?yàn)橛脛?dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)生物藥品，其面臨的最大困難就是如何去除內(nèi)源或同源蛋白。不 確定的成分，例如動(dòng)物肽類物質(zhì)的引入， 勢必會(huì)增加提取、分離、純化 步驟，一方面使成本提高，另一方面也會(huì)影響生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量。 生物制藥信息匯編 清大天一生物 第 2頁 細(xì)胞培養(yǎng)基 amp。各類添加劑（生長因子等）模式 成分復(fù)雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質(zhì)、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中的血清濃度減少時(shí)，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細(xì)胞系的生長。 激素和生長因子在大多數(shù)常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素（包括 50ng/ml的生長激 素和 1－ 10U/ml的胰島素），它們能增加多種不同類型細(xì)胞的貼瓶率；氫化可的松能提高膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的克隆形成率。生長因子包括 FGF家族、 EGF、PDGF、 IGF－ 1和 IGF－ 2及白介素等，生長因子和細(xì)胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質(zhì)起相互協(xié)同或加成作用。 另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可完全或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產(chǎn)品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產(chǎn)品的成分也不很確定。 2 細(xì)胞培養(yǎng)基配制 干粉培養(yǎng)基原倍液的配制 （ 1） 配制過濾除菌的細(xì)胞培養(yǎng)基 1） 閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑（如 NaHCO L谷氨酰胺、丙酮酸鈉、 HEPES等 ）。 2） 根據(jù)所需將 培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水 （ 20℃～ 30℃） 將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的 95%，輕微攪拌溶解。 3） 加入規(guī)定量的碳酸氫鈉 及所要添加的物質(zhì) 。 4） 輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。 5） 用 1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol / L 鹽酸溶液調(diào) pH至所需值。 6） 用 濾膜正壓過濾除菌。 7） 溶液應(yīng)在 2℃ － 8℃ 下避光保存。 具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。 （ 2） 配制可高壓滅菌細(xì)胞培養(yǎng)基 1) 根據(jù)所需 將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量 注射 用水 （ 20℃～ 30℃） 將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下 ,并入容器。加 注射 用水至總體積的 95%，輕微攪拌溶解。 2) 在 121℃ 、 15psi下滅菌 15分鐘。 3) 待溶液冷卻至室溫，加入無菌 / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌 %（ w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加 注射 用水（ 20℃～ 30℃ ）至規(guī)定體積，混勻。 4) 如果必要，用 1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol / L 鹽酸溶液調(diào) pH至所需值。 5) 溶液應(yīng)在 2℃ － 8℃ 下避光保存。 具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。 3 注意事項(xiàng) (1) 細(xì)胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經(jīng)石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產(chǎn)上一般為注射用水。 (2) 建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因?yàn)榘b一旦打開，組分可能會(huì)變質(zhì)或因受潮而結(jié)團(tuán)。 (3) 溶解干粉培養(yǎng)基時(shí)先加入終體積 90%－ 95%的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補(bǔ)足。 (4) 如需添加的組分較多時(shí)，某一組分完全溶解后，再添加另一組分。 (5) 待培養(yǎng)基完全溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產(chǎn)生沉淀。 (6) 所有成分完全溶解后，培 養(yǎng)基應(yīng)立即過濾或高壓除菌，以免產(chǎn)生沉淀或有微生物污染。 (7) 由于除菌過濾后， pH值可能會(huì)升高 ～ ，因此在過濾前，可將 pH調(diào)至比所需值低～ 。 (8) 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應(yīng)降低一些。 (9) 建議用 1N HCl或 1N NaOH來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH，因?yàn)橛锰妓釟溻c調(diào) pH值對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。如下圖所示： 生物制藥信息匯編 清大天一生物 第 3頁 圖 2 MEM SLM（ SLM120） 在相同 pH值時(shí)所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量 及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透 壓 圖 3 199（ MD502）在相同 pH值所加的碳酸氫鈉、氫氧化鈉的量及所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液滲透壓 4 滅菌方法 培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及 。與過濾相比，高壓滅菌的工作強(qiáng)度小，成本較低，但易造成營養(yǎng)成分的流失，而且在多次加樣（無菌谷氨酰胺溶液，無菌碳酸氫鈉溶液等）過程中容易造成二次污染。大多數(shù)培養(yǎng)基采用 ～ m孔徑的微孔濾膜進(jìn)行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。 壓滅菌 某些培養(yǎng)基（如 MEM）可進(jìn)行高壓滅菌 ，例如清大天一的 MEM培養(yǎng)基中的 MD60 MD609等。這類培養(yǎng)基一般不含有 L谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養(yǎng)基高壓滅菌后加入 L谷氨酰胺和碳酸氫鈉的無菌的液體。另外可高壓的谷氨酸鹽（如 L丙氨酰 L谷氨酰胺 ）可代替 L谷氨酰胺。 可高壓滅菌的培養(yǎng)基在 121℃ 、 15psi， 15分鐘 的條件下完全可達(dá)到 滅菌 效果及營養(yǎng)成分的最小損失，不需將滅菌時(shí)間延長。為保證高壓滅菌的效果，滅菌設(shè)備的驗(yàn)證很關(guān)鍵。 可供過濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為 polyethersulphone（ PES）、尼龍、多聚 碳酸鹽、醋酸 生物制藥信息匯編 清大天一生物 第 4頁 纖維素、硝酸纖維素、 PTFE、陶瓷等。一般情況下采取正壓過濾，正壓過濾較之負(fù)壓過濾具有流速高、過濾快、不易污染，可避免蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量氣泡等優(yōu)點(diǎn)。一般使用過濾器可參照各供應(yīng)商的產(chǎn)品說明書。 目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和制藥企業(yè)采用微孔濾膜濾器（如 Zeiss濾器）或立式微孔濾器（ Millipore、 Pall）除菌。微孔濾膜濾器為不銹鋼，中間可夾放 。使用這種濾器最重要步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。如在使用 Zeiss濾器時(shí)，先要用培養(yǎng)用水將濾膜充分潤濕，在安裝濾膜時(shí)可在其上放置一層定性濾紙?jiān)俟潭ā?消毒時(shí)旋鈕不要扭太緊，凡與空氣接觸部位都要包好（可用牛皮紙、紗布、無紡布等）；高壓滅菌后，在無菌環(huán)境中立即將旋鈕扭緊。過濾除菌結(jié)束后，要打開濾器，檢查濾膜是否完整，如果濾膜破裂，需重新進(jìn)行過濾除菌過程。立式微孔濾器可以選用不同的微孔濾柱體積，因?yàn)闉V膜的折疊，膜面積顯著增大，液體處理量大，而且不容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象。 5 細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存 細(xì)胞培養(yǎng)液的儲(chǔ)存條件一般為 2－ 8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點(diǎn)： (1) 過濾后的完全培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在 2～ 3周內(nèi)使用完 。 (2) 滅菌后的未加 L谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在 4℃保存 6～ 9個(gè)月，也可冷凍保存 ,用時(shí)解凍。 (3) 高壓除菌后的培養(yǎng) 基應(yīng)置 4℃保存，不能因?yàn)槠淇赡褪芨邷囟雎詢?chǔ)存溫度。 (4) 添加了谷氨酰胺的培養(yǎng)液放置 2周后，要補(bǔ)加和原來同樣量的谷氨酰胺，但這樣并不能消除谷氨酰胺降解產(chǎn)生的游離氨，建議配制好的培養(yǎng)液盡快使用。 圖 4 pH為 2mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性 圖 5 室溫下不同 pH時(shí) 10mM谷氨酰胺的穩(wěn)定性 (5) 添加某些生長因子、 激素等添加物，