【正文】 第一章 前言 酪蛋白糖巨肽 (CGMP)的研究背景 CGMP 的生物來(lái)源 酪蛋白糖巨肽（ Casein Glyacropeptide 簡(jiǎn)稱 CGMP），是 Delfour等 [1]于 1965年發(fā)現(xiàn)的一種含有唾液酸的糖肽，是乳中 κ 酪蛋白 (κ CN，惟一含有糖成分的CN)上的一個(gè)多肽片段。 κ 酪蛋白 是酪蛋白的一種，它是酪蛋白中唯一一種含有糖成分的酪蛋白，在牛脫脂乳中含量約占總酪蛋白的 13%，在人乳中占總酪蛋白的 30%。氨基酸組成分析表明， κ 酪蛋白 含有 169個(gè)氨基酸殘基，兩個(gè)胱氨酸殘基 (兩個(gè)， SH基 )，通常含有一個(gè)磷酸基，富含脯氨酸、丙氨酸、谷胺酰胺、谷氨酸等，分子量約為 104[1]。 κ酪蛋白中有半乳糖 (Gal)、 N一乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、 N一乙酰神經(jīng)氨酸 (NeuNAe)(唾液酸 )三種糖。酪蛋白糖巨肽就是水解κ 酪蛋白 產(chǎn)生的 [2,3]。 干酪加工時(shí)凝乳酶水解酪蛋白（主要是 κ CN） 的苯丙氨酸 蛋氨酸鍵，生成不溶性的副 κ CN(肽鏈的 1～ 105 部分 )和可溶性的多肽(肽鏈的 106～ 169部分 )兩部分，此多肽含有較多的碳水化合物，稱之為 ―糖巨肽 ‖，酪蛋白來(lái)源的糖 巨肽稱為 ―酪蛋白糖巨肽 ‖。 κ酪蛋白來(lái)源的 CGMP的氨基酸序列已清楚 ,它是由從 κ酪蛋白的 N 末端 106 位氨基酸 (Met) 開(kāi)始至 169 位 C 末端 (Val) 結(jié)束的 64 個(gè)殘基構(gòu)成的。牛的 CGMP有 A 和 B 2 種遺傳變異型 ,其不同在于該多肽鏈的 136 位和 148 位的氨基酸不同 ,A 型的 136 位和 148 位殘基氨基酸分別為 Thr 和 Asp ,而 B 型為 Ile 和 Ala。 此外 ,該多肽的 13 13 13 136 和 142 位的蘇氨酸殘基為配糖體化的部位 ,149 位的絲氨酸為磷酸化的部位 [2,3]。在凝乳酶凝集乳酪制造過(guò)程產(chǎn)生的乳清中含有大量的 CGMP ,有研究 [4]指出 ,甜乳清中其含量約為 ～ ,估計(jì)相當(dāng)于總?cè)榍宓鞍缀康? 20 %～ 25 %左右。 CGMP 的生物學(xué)活性 .結(jié)合霍亂毒素和大腸桿菌毒素 霍亂毒素由一個(gè)亞單位 A 和五個(gè)亞單位 B 組成，其中 B 亞基與細(xì)胞表面的寡糖受體結(jié)合以后， A亞基就會(huì)激活細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡 [5]。有研究顯示此寡糖受體是一個(gè) GM1寡糖，其結(jié)構(gòu)為： Gal β1→3GalNAcβ1→4 (NeuAcα2→3)Galβ1→ 4Glcβ1→1Cer (Glc =glucose ,Cer =ceramide) [6， 7]。此結(jié)構(gòu) 的寡糖受體與糖巨肽的寡糖結(jié)構(gòu)類似，因此 CGMP 可以作為毒素中和劑抑制霍亂毒素與受體的結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞免受毒素的侵染。 CGMP 與宿主細(xì)胞上的受體蛋白具有相似性， 優(yōu)先與細(xì)菌和病毒結(jié)合，從而抑制細(xì)菌和病毒的繁殖 [8]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明 CGMP 能夠有效 阻止齲齒、病原菌 Streptococcus mutans， S. sanguis， S. sobrinus 在口腔表面的黏附 [9， 10]，并且能夠調(diào)節(jié)牙齒菌斑的微生物，有助于控制牙齒菌斑上酸類物質(zhì)的形成，減少牙齒上羥基磷灰石分解。根據(jù)此原理， CGMP 已經(jīng)成功地申請(qǐng)專利應(yīng)用到口腔保健上 [11]。 Stan[12]等研究發(fā)現(xiàn) CGMP 能夠抑制狗的胃液分泌，減慢胃腸的蠕動(dòng)。狗被注射了 10~15mg 的 CGMP 后，它分泌的胃液酸性減弱，并且胃和十二指腸的的蠕動(dòng)減慢了。被注射 CGMP 的老鼠也有同樣的反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，胃蛋白酶消化 CGMP 產(chǎn)生了兩 個(gè)可以用 Sephadex 分離的片段， Stan 解釋說(shuō)是因?yàn)? CGMP 進(jìn)入血液從而抑制了胃液的分泌。 Aleinik[13]等人相繼也發(fā)現(xiàn) CGMP抑制胃液的分泌高達(dá) 50%，血清中的促胃泌激素也被抑制約 8%。抑制胃液分泌能夠降低動(dòng)物胃蛋白的水解作用，這樣可以保護(hù)乳中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白及溶菌酶等蛋白質(zhì)原封不動(dòng)地穿過(guò)胃，有益于嬰兒以及免疫力低下的人增強(qiáng)免疫力。 Gyy[14]首先發(fā)現(xiàn) CGMP 是人初乳和常乳中雙歧桿菌的生長(zhǎng)促進(jìn)因子。近年來(lái)的很多研究也證實(shí)了這個(gè)結(jié)論 [15]。雙歧桿菌是腸道中的益生菌，它可以抑制大腸桿菌等有害菌的生長(zhǎng)，起到預(yù)防胃腸道疾病的作用。近年來(lái)添加雙歧桿菌的多種微生態(tài)制劑已經(jīng)投放市場(chǎng)，有效地緩解乳糖不耐癥，預(yù)防和治療腸炎等疾病。 . 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng) CGMP 能夠抑制引起脾細(xì)胞增殖的促細(xì)胞分裂素的產(chǎn)生。從而抑制脾臟淋巴細(xì)胞（參與炎癥反應(yīng)）的增殖，抑制過(guò)敏反應(yīng) [16]。 Otani[17]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明這種抑制活性主要 CGMP 中的唾液酸其主要作用，如果把唾液酸消化掉，則它就不具有這樣的活性。 CMP 可與小鼠單核或巨噬細(xì)胞通過(guò)多價(jià)配位體 (例如 糖鏈及 其他陰離子基團(tuán)如磷酸絲氨酸殘基 )結(jié)合 , 誘導(dǎo)產(chǎn)生白細(xì)胞介素 1(IL 1)受體拮抗劑 ,從而抑制脂多糖介導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖 [18]。 CGMP 具有獨(dú)特的氨基酸組成，特別是幾乎不含有芳香族氨基酸，因此可作為苯丙酮尿癥患者膳食中首選的成分 [19]； CGMP 含有較多的支鏈氨基酸 (如 Val和 Ile) ，可用于多種肝病的治療 [20]；最近一些研究表明，由 CGMP 再降解所得的一些小肽有抑制血小板凝集及降低血壓效果 [21]； CGMP 能夠有效促進(jìn)鋅的吸收 [22]； CGMP 的糖鏈中 含有較多的氨基葡萄糖，對(duì)炎癥性腸疾患者有較好的療效作用；有研究證實(shí)在幼年恒河猴的乳汁中加入 CGMP 可以促進(jìn) Ca、 P、 Fe的吸收 [23]； CGMP 含有大量的唾液酸，動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明外源唾液酸的攝入能夠顯著增加腦中神經(jīng)節(jié)苷脂的數(shù)量，提高學(xué)習(xí)能力 [24]；在新生動(dòng)物中還能顯著地抑制 IgG 的產(chǎn)生，有助于下調(diào)機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，有效預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生 [25]。 腸道微生態(tài)及研究進(jìn)展 腸道微生物的形成以及分布 人體體表以及體內(nèi)存在著大量的微生物，包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和病毒等。這些微生物占 人體總重量的 1%2%， 因此從某種意義上說(shuō)一個(gè)完整、健康的成年人是諸多物種組成的復(fù)合體。 其中腸道是世界上生物密度最高的地方，每克大腸最多有 1 萬(wàn)億個(gè)微生物 [26]。其中許多微生物對(duì)人體健康起到了重要作用，他們可以協(xié)助機(jī)體的消化、吸收，對(duì)外來(lái)的病原微生物產(chǎn)生免疫應(yīng)答等[27]，而同時(shí)還有一些微生物則可能導(dǎo)致人體疾?。航Y(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。腸道微生物與宿主之間是一種互惠共生的關(guān)系 ,對(duì)維持人類健康和正常菌落穩(wěn)定的巨大貢獻(xiàn) [28]。這些細(xì)菌中有一部分是潛在的致病菌，當(dāng)腸道環(huán)境處于生理或功能性障礙時(shí)，他們能引起一系 列的感染和腐敗反應(yīng)。 腸道正常菌群的形成 新生嬰兒從無(wú)菌的環(huán)境中出生以后很快就會(huì)適應(yīng)新的環(huán)境，并成為大量微生物的宿主，這些微生物都將參與人體內(nèi)正常微生物菌群的構(gòu)建。胎兒的出生方式（自然生產(chǎn)和剖腹生產(chǎn)），嬰兒喂養(yǎng)方式（母乳喂養(yǎng)和非母乳喂養(yǎng)）甚至嬰兒出生的環(huán)境（發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家，甚至出生的醫(yī)院） 等 都會(huì)影響嬰兒體內(nèi)正常 菌群的構(gòu)建。母體產(chǎn)道中的微生物在嬰兒早期的糞樣中不會(huì)富集，只在剛出生后的前幾天內(nèi)會(huì)有，所以說(shuō)自然生產(chǎn)的嬰兒腸道微生物的構(gòu)建受母體產(chǎn)道的影響不大 [29]。 腸道內(nèi)優(yōu)先侵入的菌群可以 調(diào)節(jié)寄主腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，因此可以為它們創(chuàng)造一個(gè)合適的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)阻止其它細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此說(shuō)，個(gè)體腸道內(nèi)原始微生物的定植與個(gè)體腸道內(nèi)固定微生物的組成和分布是有很大關(guān)系的。 腸道微生物的分布 胃腸道上段 (胃及小腸 )微生物含量較少，僅有少量黏附在上皮的細(xì)菌以及其它一些過(guò)路菌。胃內(nèi)酸度高，環(huán)境中 pH較低且含大量消化酶，不適合細(xì)菌生長(zhǎng)，所以胃內(nèi)細(xì)菌數(shù)量很少，總菌數(shù) O～ 103個(gè) , 主要為革蘭氏陽(yáng)性好氧菌 , 如鏈球菌、葡萄球菌和乳酸桿菌 , 其中乳酸桿菌的數(shù)量約為 103CFU/ml。在回腸末端 , 細(xì)菌數(shù)逐漸增加 105 ～ 108 CFU/ml, 主要含乳酸桿菌 ( 102 ～ 105 CFU/ml) 、大腸桿菌、類桿菌和梭狀芽孢桿菌等。至結(jié)腸 , 細(xì)菌數(shù)明顯增加 , 濃度為 109 ～ 1012CFU/ml, 主要為厭氧菌 : 雙歧桿菌 ( 108 ～ 1011 CFU/ml) 、類桿菌、乳酸桿菌 ( 104 ～ 109 CFU/ml) 占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)為優(yōu)勢(shì)菌群 , 而有潛在致病性的梭狀芽孢桿菌和葡萄球菌僅占少量 [30]。 近年來(lái)，將分子生物學(xué)的方法應(yīng)用到腸道微生物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：一些兼性厭氧菌包括大腸桿菌、腸球菌（ enterococci）和乳酸桿菌，在人體的盲腸中達(dá)到非常高的密度和代謝活性，因?yàn)槊つc內(nèi)容物中總細(xì)菌 rRNA 的 50%都與這些菌種的一致，而糞便樣品中這些菌種 rRNA 的數(shù)量?jī)H達(dá)到 7% 。由此可見(jiàn)，這些菌種在盲腸中起到了非常重要的作用 [31]。 腸道微生物的生理功能 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們?nèi)找嫱黄苽鹘y(tǒng)技術(shù)和方法的局限 , 深刻地揭示宿主與腸道微生物之間互惠共生的分子機(jī)制 : 人體腸道向腸道微生物提供優(yōu)越的棲息和繁殖環(huán)境 , 其中包括天然的厭氧條件 , 豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) , 以及適宜的溫度和 pH 等 。 腸道微生物及其代謝 產(chǎn)物影響到人體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加工、能量平衡、免疫功能、胃腸道發(fā)育和成熟以及其他多種重要的生理活動(dòng)。一般情況下，腸道菌群與人體外部環(huán)境保持著一個(gè)平衡狀態(tài)，對(duì)人體的健康起著重要作用，但是這種平衡在某些情況下可能被打破，造成人體腸道菌群失調(diào)，從而引起 多種疾病，如：炎性腸病（ IBD）、結(jié)腸癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、遺傳過(guò)敏性皮炎、哮喘等 [29,31,32]。 最新的研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)細(xì)菌構(gòu)成的比例，甚至可能是決定是否患肥胖癥的重要因素。美國(guó)華盛頓大學(xué)教授杰弗里 戈登 等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及對(duì) 12 名減肥成功人士進(jìn)行的研究，他們 發(fā) 現(xiàn)，在眾多的腸道細(xì)菌群落中，有兩種細(xì)菌的比例關(guān)系和肥胖的發(fā)生密切相關(guān)：在肥胖的人和老鼠的腸道內(nèi)，一種名為 ―類桿菌 ‖的細(xì)菌所占的比例比較低，而另一種名為 ―厚壁菌 ‖的細(xì)菌含量較高。 保護(hù)功能：屏障作用 體內(nèi)正常微生物在腸粘膜上形成一層菌膜以抵御外來(lái)微生物的定植，因此對(duì)防止組織受到病原菌侵染方面起到很重要的作用。這種抵御作用還表現(xiàn)在限制過(guò)路菌（ opportunisic bacterial）的生長(zhǎng)。 體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌之間能夠通過(guò)爭(zhēng)奪腸道上皮細(xì)胞上的黏附位點(diǎn)而在粘膜上定植，非致病菌的黏附和定植可以阻止 隨后進(jìn)入的致病性大腸菌群在腸粘膜上皮細(xì)胞的黏附和定植 [33]。另一方面細(xì)菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)腸道內(nèi)可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)資源和資源來(lái)供自身的生長(zhǎng)和繁殖，例如：腸道內(nèi)的 Bacteroides thetaiotaomicron. (多形擬桿菌 )就是通過(guò)這種發(fā)式來(lái)發(fā)揮它的占位作用的。另外，這些腸道內(nèi)的正常菌群還能夠通過(guò)產(chǎn)生抗菌的細(xì)菌素來(lái)抑制競(jìng)爭(zhēng)菌的生長(zhǎng)，這種合成細(xì)菌素的能力廣泛地分布在胃腸道的微生物群系中，但同時(shí)寄主能夠控制這種細(xì)菌素的產(chǎn)生，因?yàn)檫@些物質(zhì)中大多數(shù)是可以被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)復(fù)合體，因此，這些細(xì)菌素的作用可以被寄主通 過(guò)位置效應(yīng)來(lái)限制的，避免微生物在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的毒素。 代謝營(yíng)養(yǎng)功能 結(jié)腸內(nèi)微生物的主要代謝功能是對(duì)未消化吸收的食物殘留和由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)生黏液進(jìn)行發(fā)酵。微生物區(qū)系基因的多樣性為機(jī)體提供了多種酶系和生化反應(yīng)途徑，這個(gè)復(fù)雜的代謝體為寄主代謝能量進(jìn)行物質(zhì)吸收， 擴(kuò)大了宿主可利用原料的范圍和提高了能量利用效率， 同時(shí)為微生物自身提供生長(zhǎng)和繁殖所需要的能量和營(yíng)養(yǎng)。 研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)飼養(yǎng)和無(wú)菌動(dòng)物在飼喂相同食物條件下 , 盡管常規(guī)飼養(yǎng)動(dòng)物消耗飼料少 , 但積蓄的體脂卻比無(wú)菌動(dòng)物多 40%這些成年無(wú)菌動(dòng)物在飼喂常規(guī)飼養(yǎng) 動(dòng)物結(jié)腸內(nèi)容物之后 , 其體脂很快恢復(fù)到了常規(guī)飼養(yǎng)動(dòng)物的體脂水 平 , 并且發(fā)現(xiàn)飼喂結(jié)腸內(nèi)容物無(wú)菌動(dòng)物體脂增加方式源自于脂肪細(xì)胞的肥大 , 而不是脂肪細(xì)胞的過(guò)度分裂增生 [33,34]。 腸道內(nèi)微生物對(duì)未消化的碳水化合物（主要有 抗性淀粉，纖維素，半纖維素，膠質(zhì)和樹(shù)膠 ）、蛋白質(zhì)（主要有 膠原質(zhì)，胰腺酶，脫落的上皮細(xì)胞和被溶解的細(xì)菌 ）和肽進(jìn)行代謝，其代謝的終點(diǎn)是短鏈脂肪酸 [34]。 所有的這些短鏈脂肪酸都對(duì)寄主生理方面有重要的功能。丁酸鹽基本都是被結(jié)腸上皮細(xì)胞消耗的，同時(shí)它還是結(jié)腸細(xì)胞主要的能量資源。醋酸鹽和丙酸鹽可能對(duì)葡萄 糖代謝也發(fā)揮著作用。 微生物在維生素 k 的合成，鈣離子、鎂離子、鐵離子的吸收過(guò)程中也起到了重要作用。碳水化合物的發(fā)酵和短鏈脂肪酸，尤其是醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的產(chǎn)生都促進(jìn)了盲腸中鐵離子的吸收。 腸道微生物與寄主免疫之間的關(guān)系 腸道不僅是吸收、消化和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的重要場(chǎng)所，也是人體最大的免疫器官。人的腸黏膜面積巨大，約 2倍于皮膚的表面，每時(shí)每刻黏膜都要接觸大量抗原，擔(dān)負(fù)著重要的免疫功能。越來(lái)越多的證據(jù)表明腸黏膜免疫功能與寄居在腸道中為數(shù)眾多的腸道菌群 (intestinal flora)有密切關(guān)系 [31]。 腸道粘膜是免疫系統(tǒng)和外部環(huán)境接觸的主要界面，因此，腸相關(guān)淋巴組織包括人體內(nèi)最多的免疫活性細(xì)胞也是不足為奇的。細(xì)菌與寄主在腸粘膜表面的交流好像在免疫系統(tǒng)的進(jìn)化方面起著重要的作用。在無(wú)菌環(huán)境下飼養(yǎng)的動(dòng)物其腸粘膜上含有的淋巴細(xì)胞密度較低，同時(shí)其血液中的免疫球蛋白濃度也較低。腸道內(nèi)微生物定植會(huì)影響腸系淋巴組織的組成。已有研究表明早年體內(nèi)腸系淋巴組織和腸道內(nèi)微生物之間的