【正文】 商用油脂的取樣和分析 P01～ P04 除臭器餾出物中的總生育酚含量 定義：本方法使用毛細管氣相色譜儀測量除臭器餾出物中的總生育酚含量（參考資料 1） 范圍：適用于除臭器餾出物。該方法基于甲硅烷基化生育酚可以通過毛細管氣相色譜進行分離。將樣本進行甲硅烷基化處理， Sylon BFT 作為硅烷化試劑，吡啶作為溶劑。十七烷硬脂酸鹽是內(nèi)標(biāo)物，α 生育酚是基準(zhǔn)物。β 、γ 和δ 生育酚的響應(yīng)因數(shù)同α 生育酚取同一個數(shù)值（注解 1）。 裝置 1. 毛細管氣相色譜儀 — 可以滿足步驟 1 中提到的操作條件 （惠普 5880A，或同類型號儀器），配有一個火焰離子化 檢測器，一個 DB－ 5 毛細管柱（ 30－ m） 2. 電子稱－精度為 ；使用 和 3. 常規(guī)實驗室玻璃器皿 — 包括移液吸管，配有 T 狀磨砂玻璃塞的錐形燒瓶 試劑 （注解，警告） 1. 吡啶 — Mallinckrodt Crom AR 等級（ American Scientific Products 有售），或同類試劑 2. Sylon BFT— Supelco 公司有售，或同類試劑 3. 十七烷硬脂酸鹽，內(nèi)標(biāo)溶液 — 實驗室按下面的步驟制備：準(zhǔn)確稱量適量的十七烷硬脂酸鹽，將其溶解在三氯甲烷里（注解，謹(jǐn)慎），最 終的濃度近似為 。見注解 2，制備十七烷硬脂酸鹽溶液 4. α 生育酚 — 參考標(biāo)準(zhǔn) 5. 三氯甲烷 — 試劑等級 步驟 1. 毛細管氣相色譜儀的條件 (a) 毛細管柱， 30－ m DB－ 5， m 薄膜厚度， （注解 3）。 (b) 恒溫箱溫度程序， 140～ 300℃： 10c/min，該過程需時 6 分鐘； 300～ 320 攝氏度：5c/min，整個過程需時 10 分鐘。 (c) 氦載氣流速近似為 2cc/分。 (d) 分流流率為 150cc/分。 (e) 注入器溫度為 240℃。 (f) 檢測器溫度為 345℃。 (g) 標(biāo)繪器記錄紙速為 1cm/min。 (h) 衰減為 2 (i) 閥值為 1 (j) 色譜峰區(qū)域?qū)挾葹? 2. α 生育酚相應(yīng)因數(shù)的測定 (a) 準(zhǔn)確稱量 20～ 30mg的α 生育酚，倒入容量為 50mL 的錐形燒瓶中。 (b) 加入 1mL的吡啶， 2mL 的 Sylon BFT。加熱 10 分鐘左右，至 50℃，偶爾進行攪拌，或直到固體完全融解為止。 (c) 將燒瓶輕微冷卻。加入 的內(nèi)標(biāo)溶液（試劑 3）和 15mL 的三氯甲烷。充分混合。 (d) 按照要求的條件，向色譜儀中注入 1μ L 試液（步驟 1）。圖 1 是一個典型的毛細管色譜圖；圖 2， 3 是填充塔色譜圖。 商用油脂的取樣和分析 (e) 計算相應(yīng)因數(shù)（ FC） FC＝ISdardSdardSIS CA CA ??tantan 式中： ISA ＝十七烷硬脂酸鹽的面積 ,內(nèi)標(biāo)物 dardSAtan ＝α 生育酚的面積 dardSCtan ＝ α 生育酚的質(zhì)量 mg ISC＝十七烷硬脂酸鹽的質(zhì)量 mg，內(nèi)標(biāo)物 (f) β 、γ 和δ 生育酚的響應(yīng)因數(shù)同α 生育酚取同一個數(shù)值 FC＝ISdardSdardSIS CA CA ??tantan 式中： ISA ＝十七烷硬脂酸鹽的面積 ,內(nèi)標(biāo)物 dardSAtan ＝α 生育酚的面積 dardSCtan ＝ α 生育酚的質(zhì)量 mg ISC＝十七烷硬脂酸鹽的質(zhì)量 mg，內(nèi)標(biāo)物 注 －每天都要重新測量這些因數(shù)。一個星期后要制備新的溶液，不用時應(yīng)冷藏。 3. 制備樣品 (a) 加熱樣品，并充分搖動。準(zhǔn)確稱量 180～ 250mg的樣品，放入到容量為 50mL 的錐形燒瓶中。 (b) 加入 1mL的吡啶，然后再加入 2mL左右的 Sylon BFT。加熱 5～ 10 分鐘，至 50℃，或直到固體完全融解為止。 (c) 加入 的內(nèi)標(biāo)溶液（試劑 3）和 15mL 的三氯甲烷。充分混合。 (d) 按照要求的條件，向色譜儀中注入 1μ L 試樣（步驟 1）。 計算 1. 樣品中的總生育酚含量以α 、β 、γ 和δ 生育酚的總重量百分?jǐn)?shù)表示： 100% ?? ??? SA CFCAX IS ISX 式中： X% ＝α 、β 、γ 和δ 生育酚的重量百分?jǐn)?shù) XA ＝α 、β 、γ 和δ 生育酚的面積 FC ＝從步驟 2（ e）中得到的相應(yīng)因數(shù) ISC ＝十七烷硬脂酸鹽的質(zhì)量 mg S ＝樣品質(zhì)量 mg 商用油脂的取樣和分析 2. 總生育酚含量％＝％α 生育酚＋％β 生育酚＋％γ 生育酚＋％δ 生育酚 圖 1 含有膽固醇和內(nèi)標(biāo)物的除臭器餾出物所特有的毛細管色譜圖 圖 2 含有菜子甾醇的除臭器餾出物的填充塔色譜圖，存在一個內(nèi)標(biāo)物干擾峰 圖 3 發(fā)生皂化 作用后的除臭器餾出物的填充塔色譜圖，內(nèi)標(biāo)物干擾峰下方存在一個膽固醇干 擾峰 標(biāo)定 1. 生育酚溶液的制備和相應(yīng)因數(shù)的計算【步驟 2（ e）】可以滿足標(biāo)定的需要。 2. 需要一個生育酚總濃度已知的二級標(biāo)準(zhǔn)溶液，以進行附加標(biāo)定。 精度 1. 準(zhǔn)確度 — 通過向 6 個除臭器餾出物樣品中摻加濃度已知的（ 12～ 72mg）α 生育酚來測定該試驗的準(zhǔn)確度。摻加物的平均回收率為 ％。β 、γ 和δ 生育酚的準(zhǔn)確度無法測定。 2. 精度 — 該試驗的精度通過下面的方法測定：將樣品分為 10 份，分別裝入管形瓶，每天測定 1 個，總共測 10 個。所有的試驗由一個試 驗員使用同一套裝置進行。計算出的生育酚總含量的變異系數(shù)為177。 ％。 3. 見注解 1，檢查潛在的誤差源。 4. 表 1 中總結(jié)了聯(lián)合試驗的統(tǒng)計數(shù)字 注解 警告 Sylon BFT 是一種強硅烷化試劑，含有 1％的三甲基色氨酸和 99％的 2－三甲硅烷基三氟乙酰胺，在通風(fēng)良好的通風(fēng)櫥中使用。該物質(zhì)易燃性很高。 吡啶易燃，容易引起火災(zāi)。在空氣中的爆炸極限為 ％～ ％。不慎吞食和吸入時可以造成中毒。在空氣中的 TLV為 5ppm。與比提純后的吡啶相比，未提純的危險性更大。締合同系物和雜質(zhì)的毒性超過了吡啶本身。 三氯甲烷是一種已知 的致癌物質(zhì)。吸入即可引起中毒，有麻醉作用。要避免與皮膚接觸。長期吸入，或者誤食會對肝和腎造成傷害，嚴(yán)重時會致命。該藥品不易燃，但長時間接觸火焰，或高溫會引起藥品燃燒。在空氣中的 TLV為 10ppm。在通風(fēng)櫥中使用。 使用吡啶、 Sylon BFT 和三氯甲烷時要佩戴手套，保持良好的通風(fēng)。 編號注解 1. 誤差源 — 加熱失敗和充分混合樣品會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。生育酚未能完全硅烷化時，所得的結(jié)果偏低。樣品未能妥善保藏時，可能會造成生育酚中毒，如此帶來偏低的結(jié)果。 2. 十七烷硬脂酸鹽（ HDS）的制備－ (a) 稱量 50g 十七烷醇（ Eastman 化學(xué)藥品 No10411，或同類藥劑），倒入容量為 1L的燒杯中，結(jié)晶。加入 30L氯化硬脂酰（純度為 98＋％， Eastman化學(xué)藥品 No P2227，或同類藥劑）。通風(fēng)櫥中蒸汽浴 2 小時。 警告 — 反應(yīng)物融解，反應(yīng)進行的過程中，氯化氫釋放大量熱量。 (b) 沸騰結(jié)束以后，偶爾用玻璃棒攪拌反應(yīng)混合物。將粗制品融解在 800mL 乙醇中（需加熱）。室溫下結(jié)晶 2個小時（至少）。使用布氏漏斗分離出結(jié)晶物。用乙醇融解、結(jié)晶過濾，商用油脂的取樣和分析 上述步驟重復(fù) 4 次。在最后一次過濾時，將產(chǎn)品置于漏斗中干燥 1～ 2 小時。將產(chǎn)品轉(zhuǎn)入燒杯中，置于 150℃的電熱板上，進行融化，直到恒重。制備的 HDS 待用。 3. 只裝備了填充塔氣相色譜儀的實驗室會嘗試使用大口徑毛細管柱。然而，它可能無法溶解β 、γ 和δ 生育酚。應(yīng)使用它們的樣品來測定這些生育酚異構(gòu)體在大口徑毛細管柱中的溶解量。 參考資料 1. This Method was developed at Distillation Products Division of Eastman Kodak. Rochester. NY. The method was studied collaboratively during 1985 and 1986, and is published in J. Am. Oil. Chem. Soc. 65:1936（ 1988） . 2. Collaborative study results appear in Ibid. 65:881（ 1988） . 表 1 合作研究的統(tǒng)計數(shù)字 a Con mg/g α β γ δ 合計 RSDr α 0 0 0 β 0 0 0 116 γ δ 合計 RSDR α 0 β 116 116 116 γ δ 合計 a 參見參考資料 2 P05～ P06 不皂化物 定義：不皂化物可溶于油脂。包括那些經(jīng)過苛性堿處理而不能發(fā)生皂化，但可溶于一般的油脂溶劑中的物質(zhì)。這些化合物包括：高脂肪醇、固 醇、顏料和碳氫化合物。 范圍：應(yīng)用于一般的動物油脂和植物油脂。但不適用于含有過量不皂化物的油脂，例如，船用照明油。還不適用于原料油。 裝置 1. 萃取筒 — 帶有刻度、玻璃塞。容量為 200mL（注解 1）。 2. 錐形燒瓶，或索氏燒瓶 — 容量為 100— 200mL。 3. 分液漏斗 — 容量為 500mL。 4. 玻璃虹吸管 — 參見步驟 3 和注解 1。 商用油脂的取樣和分析 試劑 1. 95％乙醇－ USSD 化學(xué)式 30 和 3A。 2. 含水氫氧化鉀（ KOH） — 重量百分?jǐn)?shù)為 50％。將 60g的試劑級 KOH 溶解在 40mL 的蒸餾水中制得，過程需要冷卻（注解，警告）。 3. 石油醚 — 參見 AOCS 的說 明書 H2－ 41（注解，警告）。 4. 氫氧化鈉溶液（ NaOH） — 進行了準(zhǔn)確的標(biāo)定。參見 AOCS 的說明書 H12－ 52。 5. 酚酞指示劑溶液 — 用 95％乙醇溶解并稀釋至酚酞含量為 ％。 步驟 1. 準(zhǔn)確稱量 5g177。 的樣品（充分混合），倒入錐形燒瓶，或索氏燒瓶。加入 30mL的 95%乙醇和 5mL 的 50％ KOH 溶液。緩慢，連續(xù)煮沸，回流 1 小時，或直到樣品完全皂化。完全皂化是十分必要的。 2. 轉(zhuǎn)入萃取筒中，加 95%乙醇至 40mL 刻度處，進行清洗。全部轉(zhuǎn)入圓筒中，先加入熱的蒸餾水，后加入冷的蒸餾水，直至 80mL 刻度處。 用少量的石油醚（ 5mL）清洗燒瓶，然后將液體倒入圓筒中。將筒中物質(zhì)冷卻至室溫（ 20～ 25℃），然后加入 50mL 石油醚。 3. 蓋上瓶塞，劇烈搖動至少 1分鐘。澄清，待分層變得清晰。用玻璃虹吸管將上層溶液盡可能地戲出，避免吸入下層溶液（見注解 1）。 4. 石油醚萃取物在容量為 500mL 的分液漏斗中混合。 5. 使用相同數(shù)量的石油醚（ 50mL）進行重復(fù)萃取，至少 6 次。過程中需要劇烈搖動（注解 2）。 6. 使用 25mL 的含有 10％乙醇的蒸餾水，將分液漏斗中的萃取物清洗 3 次，劇烈搖動。每次萃取結(jié)束后，將含水乙醇層吸出。避免吸出石油醚層。 連續(xù)使用 10％ 的乙醇溶液清洗，直到吸出溶液在滴加一滴酚酞指示劑（試劑 5）后不再呈現(xiàn)粉色為止。（見注解 3）。 7. 將石油醚萃取液轉(zhuǎn)入一個配衡燒杯中。水浴蒸發(fā)至干燥，過程中緩慢地注入一股清潔、干燥的氮氣。在溶液完全蒸發(fā)后，將殘余物放入一個真空爐中，溫度為 75～ 80℃，內(nèi)部壓力為不高于 200mm水銀柱，繼續(xù)干燥，直到質(zhì)量恒定。在干燥器中冷卻，稱量。在計算式中，以“ A”代表該數(shù)值。 8. 在稱量后，將殘余物溶解在 50mL 的 95％乙醇溶液中，該溶液的溫度為 50℃，滴加有酚酞指示劑，并預(yù)先進行了中和。使用 的 NaOH 進行滴定，至溶液變紅。校正殘余物的重量（注解 3），使用下面的關(guān)系得出游離脂肪酸的含量： NaOH等于 油酸。 在計算不皂化物百分含量的式中，用“ B”代表通過該滴定得出的脂肪酸重量（注解 3）。同時應(yīng)該對試劑進行空白校正。 9. 使用不含油脂的不皂化物重復(fù)上述操作，就可以對所有的空白測定進行校正。在計算式中用“ C”代表所得到的數(shù)值。 計算 1. 不皂化物 ? ?? ? 100g% ???? 樣品重量 CBA 式中： A ＝殘余物的重量 B ＝脂肪酸的重量 C ＝空白測定中試劑的重量 商用油脂的取樣和分析 精度 1. 無法得到以 AOCS（美國石油化學(xué)家協(xié)會） Official Method Ca 6a40 實際聯(lián)合研究為基礎(chǔ)的統(tǒng)計數(shù)字。 1985～ 1986 年間開展了 Smalley 樣品檢查計劃，下表中的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值（ SR），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差百分?jǐn)?shù)（ RSD％）和再現(xiàn)性參考了該計劃所得出的結(jié)果（參見AOCS