【正文】 XX 體內(nèi) HSC 靶向性、抗肝纖維化效果比較與評價。 3 擬采取的研究方案及可行性分析 研究方案： 第一部分 XXXXX 及 XXXXX 合成 (1) XXXXXX 合成及鑒定 采用我們研究室建立的方法，化學(xué)合成 XXXXXX。應(yīng)用 XXXXXXXXXX。合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（ HPLC）、質(zhì)譜等方法鑒定合成產(chǎn)物純度及分子量。 反應(yīng)圖（略） (2) XXXXXXXXXXX 采用一步法合成。 XXXXXXXXXXXX。 合成反應(yīng)圖示如下。高效液相（ HPLC）和質(zhì)譜分析法進物產(chǎn)物純化與鑒定。 反應(yīng)圖（略） 第二部分 長循環(huán)脂質(zhì)體制備、鑒定與 技術(shù) 條件優(yōu)化 (1) 脂質(zhì)體制備 采用經(jīng)我們改良的逆相蒸發(fā)法制備 。 具體方法如下： XXXXXXXXXX。 (2) 性質(zhì)鑒定 XXXXXXXXXXXXXXXX。 (3) 均勻設(shè)計優(yōu)化處方 根據(jù)實驗結(jié)果及文獻，確定影響包封率的主要因素。以包封率為評價指標，采用二項逐步回歸計算回歸方程，并進行方差分析，優(yōu)化條件。 第三部分 XXXXX 修飾 長循環(huán) 脂質(zhì)體與 HSC 體 外結(jié)合活性 采用兩步膠原酶灌注和密度梯度離心法分離大鼠 HSC，選擇靜止態(tài)和激活態(tài)的 HSC，接種于 6孔板上 (細胞密度為 105/mL)。待貼壁后， 1%胎牛血清 DMEM培養(yǎng)過夜，細胞同步化。 (1)配體結(jié)合的濃度 效應(yīng)關(guān)系 XXXXXXXXXXX。 (2) 配體結(jié)合的時間 效應(yīng)關(guān)系 XXXXXXXXXXXX。 (3) 競爭抑制 XXXXXXXXXX。 (4) 細胞熒光定位、配體表面結(jié)合率與內(nèi)吞率測定 XXXXXXXXXX。 (5) 平衡解離常數(shù) (Kd )和細胞最大結(jié)合位點數(shù) (Bmax) XXXXXXXXXXX。 第四部分 XXXXXXX 對 HSC 生物學(xué)特性影響與機制 采用酶法分離大鼠 HSC。新鮮分離的 HSC，體外培養(yǎng) 48 h 后，作為靜止期HSC 用于下游實驗，或培養(yǎng) 1 w 后消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，作為活化的 HSC用于下游實驗。 (1) XXXXXXX 對 HSC 活化狀態(tài)影響 XXXXXXXXX。 (2)XXXXXX 對 TGFβ1效應(yīng)影響 XXXXXXXXXXXX。 (3)XXXXXXXX 大鼠 HSC TGFβ 受體 XXXXXXX 信號通路影響 XXXXXXXXXXXXXX。 第五部分 XXXXXXXXXXXX (1) XXXXXXXX 在肝纖維化 大鼠體內(nèi)的器官分布 XXXXXXXXXX。 (2) XXXXXXX 大鼠體內(nèi) 藥代動力學(xué) 采用 XXXXXXXX。 (3)XXXXXXX 在肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)分布 采用 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。 第六部分 XXXXXXX 防治大鼠肝纖維化 (1)造模 采用膽總管結(jié)扎和 CCl4肝纖維化兩種動物模型。 (2)分組及處理 XXXXXXXXXXXXXX。 (3)治療效果檢測 主要比較以下指標： XXXXXXXXXXXXXXX。 技術(shù)路線圖（略）。 立項依 據(jù)有堅實的理論與實踐基礎(chǔ) 。本研究是參閱大量文獻并結(jié)合 自身以往深厚的 肝纖維化防治 研究基礎(chǔ) ，特別 是結(jié)合 近四 年國家自然科學(xué)基金資助研究成果，在 XXXX 化學(xué)合成及功能研究、低劑量 XXX抗肝纖維化作用和機制的前期 工作基礎(chǔ)上 ，提出的 多途徑、 互補協(xié)同與靶向 治療肝纖維化的新探索。掌握 了 國內(nèi) 外 在 受體調(diào)節(jié)藥物靶向 、 低毒性高效中藥新劑型開發(fā) 和 以HSC的靶標的肝纖維化靶向治療 中的最新研究動態(tài)， 借鑒“雙靶向”干預(yù)的最新 研究成果，并與自身實踐相結(jié)合 ，在理論上、實踐上均有可靠基礎(chǔ)。 相關(guān)實驗技術(shù)成熟，實驗結(jié)果可信 。本研究使 用的實驗方法、動物模型和 生物分子化學(xué)合成 等多為國內(nèi)外應(yīng)用多年的經(jīng)典方法 ，并有自身實踐基礎(chǔ) 。本課題組 由 掌握以上技術(shù)的成員 組成 ，相關(guān)技術(shù)已應(yīng)用于科研工作。 人員配備合理，具有扎實的相關(guān)工作基礎(chǔ)和完善的實驗設(shè)備及技術(shù)支持 。 申請人長期從事 肝纖維化防治研究 ， 先后承擔(dān)包括國家自然基金在內(nèi)的各類科研項目 15項，指導(dǎo)或協(xié)助指導(dǎo)博士后、博士生及碩士生 70余名。近四年主持了國家自然科學(xué)基金 項目 “RGD修飾細胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究 (編號 30170412） ”和 “人卵泡抑素防治肝纖維化的實驗研究 (編號30170411)”的研究工作 ，項目組主要成員參與并完成以上研究工作。 實驗 設(shè)計 指導(dǎo)者、熟練技術(shù)人員及輔助人員等各司其職， 可 保障 研究 有條不紊的進行。新華醫(yī)院消化內(nèi)科系 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院（原 上海第二醫(yī)科大學(xué) ）國家級重點學(xué)科 和“ 211”工程重點建設(shè)學(xué)科的 組成單位之一，長期從事肝纖維化防治研究，先后承擔(dān)包括國家自然科學(xué)基金在內(nèi)的各級各類科研項目 20余項。2021年 7月，原上海第二醫(yī)科大學(xué)與原上海交通大學(xué)合并，組建新的上海交通大學(xué)。作為上海交通大學(xué)的附屬單位，將在科研究設(shè)備和技術(shù)上更方便的得到比以往更廣泛的支持。 4 本項目 的特色與創(chuàng)新之處 本課題 首次嘗試利用 XXXXXXX 構(gòu)建 HSC 特異性受體調(diào)節(jié)藥物靶向載體。將新型配體人工化學(xué)合成、受體調(diào)節(jié)藥物靶向技術(shù)與新型脂質(zhì)體載藥技術(shù)三者結(jié)合應(yīng)用于肝纖維化防治， 有很強的原始創(chuàng)新性 。 本課題 首次研究 XXXXX生物小分子通過 XXXXX與中藥粉防己堿相聯(lián)合，多途徑、互補與協(xié)同防治肝纖維化。本課題是利用分子機制指導(dǎo)中西藥聯(lián)合應(yīng)用、構(gòu)建中藥靶向制劑提高療效 降低副作用 和多途徑協(xié)同作用抗肝纖維化的全新嘗試，是在總結(jié)自身工作基礎(chǔ)上進行的大膽設(shè)想與創(chuàng)新。 5 年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果 年度研究計劃： 略 預(yù)期研究成果 獲得快速、有效和大量合成 XXXXXXX 和 高藥物包封率、高配體修飾率的穩(wěn)定 XXXXXXXX 的技參數(shù)，并合成足量研究相關(guān)產(chǎn)物。 體外研究證實 XXXXXXXX。 在體內(nèi) XXXXXXXXX，有效 降低有效劑量、提高療效和 降低副作用 。 研究證實 XXXXXXX可成為抗肝纖維化藥物新劑 型開發(fā)的有效載體。 （二）研究基礎(chǔ)與工作條件 1 研究 基礎(chǔ) 既往肝纖維化防治理論和技術(shù)。 自 1981 年以來，我們 研究室 長期從事肝纖維化防治研究，先后對鈣拮抗劑、鈣調(diào)蛋白拮抗劑、大黃素、激活素、腎素 血管緊張素系統(tǒng)及卵泡抑素等在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用進行了 系列 的研究，積累 了較 豐富 的 理論 ，掌握了相關(guān)研究技術(shù)。承擔(dān)了包括國家自然科學(xué)基金在內(nèi)的各類科研項目 20 多項，先后獲省部級以上科技進步獎 10 項。 粉防己堿抗肝纖維化研究工作積累。 項目負責(zé)人率先在我國 開展鈣拮抗劑尤其是中藥 粉防己堿 對肝纖維化防治研究， 取 得豐富的粉防己堿抗肝纖維化基礎(chǔ)和臨床研究成果，在國內(nèi)外期刊發(fā)表相關(guān)論文 50 余篇，獲省部級以上科技進步獎 5 項。近兩年，我們在上海市教委基金項目“ 粉防己堿影響肝星狀細胞活化信號分子研究（編號 02BK14） ”資助下完成了小劑量粉防己堿抗肝纖維化效果與機制的研究，在國內(nèi)外首次報道小劑量粉防己堿可通過影響 TGFβ Smads信號通路抑制 HSC 活化，相關(guān)研究論文被 SCI 收錄 (收錄號 IDS Number: 963XN)。該研究為指導(dǎo)粉防己堿在肝纖維化防治中應(yīng)用有重要價值。（參見申請人簡歷及附件二、三） 生物小分 子化學(xué)合成及脂質(zhì)體構(gòu)建相關(guān)工作基礎(chǔ)。 近四年 來，申請人承擔(dān) 并完成了國家自然科學(xué)基金項目 “RGD 修飾細胞生物信息調(diào)控分子和綴合基因的功能研究（編號 30170412） ”， 化學(xué)合成了 RGDM6P， 分子克隆構(gòu)建pCIRGDSmad7 并成功通過脂質(zhì)體進行基因轉(zhuǎn)染， 通過體內(nèi)外實驗觀察 了RGDM6P 和 pCIRGDSmad7 的生物學(xué)效應(yīng) 。 細胞及動物學(xué)實驗均證實pCIRGDSmad7 和 RGDM6P 可減輕 ECM 沉積，并影響 TGFβ1和整合素表達強度和分布 。主要研究工作由本項目組成員參與并完成。 目前 我們正在利 用基金很少量結(jié)余款項進行合成 RGDM6P 修飾 SSL 的工作。 得益于此，他（她）們分別熟練掌握了 生物小分子的化學(xué)合成相關(guān)技術(shù)（多肽合成、 固相化反應(yīng)、納米 技術(shù)、高效分離技術(shù) 等）、 免疫組織與細胞化學(xué)技術(shù)、 RTPCR 和定量 PCR、蛋白印跡 、高效液相分析、質(zhì)譜分析、肝纖維化動物模型 及生物信息學(xué)方法等與 本課題相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)與方法 （相關(guān)論文參見申請人簡歷）。由于以上的工作基礎(chǔ)，我們擁有豐富的生物分子合成經(jīng)驗，成熟的生物分子構(gòu)建技術(shù)和良好的人員與設(shè)備支持。已經(jīng)構(gòu)建成功的 RGDM6P 及相關(guān)技術(shù)要領(lǐng)，可直接用于本課題。構(gòu)思本課題的重要原因之一是探討解決簡單單一藥物治療中發(fā)現(xiàn)的諸多問題而開展的，密切相關(guān)的細胞學(xué)、動物學(xué)