【正文】 ..........9 ...................... 10 第二部分 課程設(shè)計(jì)部分 .........................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ................................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 卵巢 ...............................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 實(shí)驗(yàn)用的儀器 .................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 實(shí)驗(yàn)試劑 ........................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ........................................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 卵丘 卵母細(xì)胞 復(fù)合體（ COCs） 的 收集 ...........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ...........................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 .......................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 卵母細(xì)胞的成熟觀察 ................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 3. 設(shè)計(jì) ......................................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 丘細(xì)胞存在對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響 ........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ............................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 胞體外成熟的影響 ........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ................................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 參考文獻(xiàn) .......................................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 1 第一部分 文獻(xiàn)綜述 母細(xì)胞體內(nèi) 成熟的生理機(jī)理 卵母細(xì)胞成熟是指卵母細(xì)胞恢復(fù)和完成第一次減數(shù)分裂，進(jìn)入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期，此間伴隨著胞漿成熟，即卵母細(xì)胞的成熟包括其核成熟和胞漿成熟兩個(gè)方面 [v]。核成熟是核膜破裂，同源染色體分離和排出第一極體；胞漿成熟是胞漿內(nèi)各種蛋白組成達(dá)到一定水平及線粒體的有效重排。 卵母細(xì)胞體外成熟（ IVM）是指在體外人工給定的條 件下，哺乳動(dòng)物次級(jí)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)一系列的生長(zhǎng)發(fā)育最終形成有受精能力的成熟卵母細(xì)胞的過(guò)程。卵母細(xì)胞的體外成熟包括細(xì)胞核的成熟、細(xì)胞質(zhì)的成熟、卵丘細(xì)胞的成熟、透明帶的成熟以及其卵丘 卵母細(xì)胞復(fù)合體的發(fā)育成熟等一系列復(fù)雜的變化過(guò)程，主要表現(xiàn)在細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟兩個(gè)方面。在形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為紡錘體形成，核仁致密化，染色質(zhì)高度濃縮成染色體，第一極體釋放，細(xì)胞器重組，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、膨脹和透明帶軟化等一系列生理變化 [vii]。 細(xì)胞核成熟即卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂 (genninal vesiclebreakdown， GVBD)并發(fā)育到第一次減數(shù)分裂中期；與此同時(shí)，卵母細(xì)胞進(jìn)一步跨越第一次減數(shù)分裂中期，排出第一極體 (第一極體含有極微量的細(xì)胞質(zhì)，不久就退化 )并停止于第二次減數(shù)分裂的中期，直到受精 (或激活 )后才完成第二次減數(shù)分裂并排出第二極體。 細(xì)胞質(zhì)的成熟包括細(xì)胞器的變化和細(xì)胞基質(zhì)的變化，皮質(zhì)顆粒在胞質(zhì)合成后，逐漸遷移到質(zhì)膜下的皮質(zhì)區(qū)。高爾基復(fù)合體最初位于核的周圍，成熟過(guò)程中移向皮質(zhì)，皮質(zhì)顆粒完全形成后，高爾復(fù)合體在皮質(zhì)中消失。發(fā)育早期的線粒體為圓形或橢圓形等，主要分布于皮質(zhì)部，卵母細(xì)胞成熟后，線粒體又移向核周圍， 形成幼稚型線粒體。隨著卵母細(xì)胞的成熟，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得很少。胞質(zhì)成熟一個(gè)非常重要的特點(diǎn)是積累一些穩(wěn)定的 mRNA，并在卵母細(xì)胞成熟到一定階段進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 2 有些細(xì)胞質(zhì)成熟過(guò)程依賴于細(xì)胞核成熟。 透明帶軟化也是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志。透明帶是一層糖蛋白膜，受精時(shí)可以結(jié)合并誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，并阻止多精受精。 在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中，有很多化學(xué)物質(zhì)及因子參與反應(yīng)，因此，只有當(dāng)體外成熟條件與體內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育所需要的環(huán)境非常接近時(shí)，才能獲得較高的成熟率，從而為進(jìn)一步的科研工 作提供優(yōu)質(zhì)大量成熟的卵母細(xì)胞。 2. 影響豬卵母細(xì)胞體外成熟的因素 卵巢來(lái)源豬的年齡、品種及健康狀況 同一種動(dòng)物在不同年齡段其卵母細(xì)胞在體外成熟的情況也有所不同。從初情期前的青年母豬卵巢中獲得的豬卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外成熟培養(yǎng)后可得到 IVP 后代，但是，成功的效率不如經(jīng)產(chǎn)母豬卵巢體外成熟的卵母細(xì)胞。 不同的國(guó)家和地區(qū)之間，豬的品種必定存在著遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境和氣候條件等等的因素而帶來(lái)品質(zhì)上的差異，從而影響豬卵母細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)而對(duì)體外成熟培養(yǎng)也產(chǎn)生一定的影響。 而即使是從同一品種和統(tǒng)一地區(qū)的豬種所獲得的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，其培養(yǎng)效果也會(huì)因豬的健康情況和卵巢質(zhì)量等的影響而有很大的不同，比如，處在育齡盛期的健康母豬，其卵巢的體積大，表面卵泡多而且直徑在 36mm 的卵泡相對(duì)比例就會(huì)較高，抽得的卵母細(xì)胞形態(tài)完好，裸卵少，相對(duì)體外成熟培養(yǎng)效果也好。反之，取自仔豬、處女豬、老母豬及老弱病殘豬的卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)效果則較差。 所采集的卵巢所處的性周期同樣影響卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)結(jié)果，根據(jù)采集卵巢所處的性周期，將其分為卵泡期和黃體期，再將 黃體期卵巢分為有黃體期卵巢和無(wú)黃體期卵巢。無(wú)黃體期卵巢上的卵母細(xì)胞比黃體期卵巢上卵母細(xì)胞成熟效果要好。崔亞利等認(rèn)為豬卵泡期卵母細(xì)胞的培養(yǎng)效果要高于黃體期，但差異不顯著。彭輝等研究表明，在牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)中，有著同樣的燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 3 結(jié)果，即卵泡期卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)結(jié)果要高于黃體期 [xxvi]。因此，卵巢所處性周期不同，卵泡內(nèi)的能量物質(zhì)、激素濃度等也會(huì)隨之而發(fā)生變化，進(jìn)而影響了體外成熟培養(yǎng)的結(jié)果。 一般而言，卵巢離體的時(shí)間要求在 2~4h 內(nèi)，時(shí)間越短，所獲得的卵母細(xì)胞的質(zhì)量 越好，體外成熟培養(yǎng)的效果也越好。文國(guó)藝等 [xxvii]研究認(rèn)為，豬卵巢離體時(shí)間越短，其卵母細(xì)胞的卵裂率越高，并且隨著離體時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。相對(duì)于其他哺乳動(dòng)物而言，豬卵母細(xì)胞對(duì)溫度的敏感度較高，較高或較低都會(huì)直接影響到體外成熟的效果，一般來(lái)講，豬卵巢的保存溫度在 28~35℃ ，文國(guó)藝等研究表明，當(dāng)卵巢的保存溫度低于 25℃ ，豬卵母細(xì)胞體外成熟收到明顯的影響并進(jìn)而影響到受精的結(jié)果 。 ，普遍認(rèn)為進(jìn)行體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞在 3~8mm，培養(yǎng)效果較好。 Yoon等研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自3~8mm直徑卵泡 的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于 3mm的卵泡卵母細(xì)胞 (91%vs 58%)。韓毅冰等也證明小直徑卵泡卵母細(xì)胞 (1~2 mm)成熟率不如大直徑卵泡卵母細(xì)胞（ 2~6mm）。但在特別大的卵泡中有些卵母細(xì)胞有嚴(yán)重退化的現(xiàn)象。 大多數(shù)哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞被卵丘細(xì)胞包裹形成 COCs） 。排卵之前，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，合成大量胞外基質(zhì)，并富含透明質(zhì)酸（ Hyaluronic： HA），有利于排卵后進(jìn)入輸卵管，同時(shí)保證了卵母細(xì)胞正常的受精和胚胎發(fā)育潛力，所以，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張對(duì)卵母細(xì)胞成熟，特別是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟起著重要作用。根據(jù)卵母細(xì)胞外 面包裹的卵丘細(xì)胞的層數(shù)將其分成三級(jí) 。 A 級(jí) ： 卵丘細(xì)胞在 3 層或 3層以上。 B 級(jí)：卵丘細(xì)胞為 1~2 層；或卵丘細(xì)胞雖在 3 層或 3 層以上，但是不完整，部分為