elisa講義-文庫(kù)吧
2025-11-05 05:25 本頁(yè)面
【正文】 的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。,1. ELISA的原理,第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。,ELISA技術(shù)原理,1. 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 2. 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性。 3. 酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。 4. 受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。 5. 此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。 6. 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（pgng/ml水平），并且重復(fù)性好。,第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。,1.1 抗原抗體反應(yīng),1.1.1 可逆性,抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為： Ag+Ab→AgAb,抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[AgAb]／[Ag][Ab] ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。,第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。,1.1.2 特異性,抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。,1.1.3 最適比例,第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。,1.1.4 敏感性,化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平 酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為510μg/ml 免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。,第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。,2 ELISA的類型,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑： （1）固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑“（immunosorbent）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物“（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。,第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)。,雙抗體夾心法測(cè)抗原,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。,樣品（抗原）,酶標(biāo)抗體,底物,酶標(biāo)儀測(cè)定OD值,終止液,第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。,雙抗原夾心法測(cè)抗體,用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。,第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；A （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； B （3）酶的底物； C （4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液,第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。,3.1 ELISA的試劑準(zhǔn)備 A,固相載體 聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。 良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。 將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被(coating)。 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：0.05%0.5%的BSA。 10%的小牛血清或1%明膠。脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。 洗滌液：在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20
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