反芻動(dòng)物源性枯草芽孢桿菌的分離與鑒定畢業(yè)論文-文庫(kù)吧
2025-06-07 15:39 本頁(yè)面
【正文】 內(nèi)大腸桿菌、沙門氏菌的數(shù)量，減少機(jī)體內(nèi)致病菌 [2]，改善了乳酸桿菌等厭氧菌的生長(zhǎng)環(huán)境，增加有益菌，以此來(lái)保持腸道菌群的平衡，提高動(dòng)物機(jī)體抗病能力。 同時(shí) 枯草芽孢桿菌具有耐 受高溫、耐酸、耐擠壓等特點(diǎn) ，在飼料加工和儲(chǔ)存過(guò)程中不易失活 [35]。 枯草芽孢桿菌菌體自身合成α 淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶 、纖維素酶等酶類，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，可 將淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，能提高動(dòng)物對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)的消化和吸收率；其還能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如維生素、氨基酸、促生長(zhǎng)因子等，參加機(jī)體新陳代謝，利于動(dòng)物機(jī)體吸收，使動(dòng)物保持健康狀態(tài)；還具有降解碳水化合物的酶如纖維素酶、葡聚糖酶 [67]。 枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮 了 巨大作用， 并且 已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。針對(duì)雞、豬、水產(chǎn)等已有大量報(bào)道，丁祥力等利用枯草芽孢桿菌 WH5凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖廠的水[10]，魏姍姍等從健康仔豬空腸黏膜分離到 23 株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢桿菌 [11]，雖然枯草芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑在反芻動(dòng)物中還沒(méi)有廣泛應(yīng)用，但近年來(lái)，枯草芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中的研究越來(lái)越多。本試驗(yàn)從健康奶牛糞便中分離鑒定枯草芽孢桿菌，以期為進(jìn)一步深入研究枯草芽孢桿菌提供參考，并為枯草芽孢桿菌作為反芻動(dòng)物微生態(tài)制劑的研制和應(yīng)用提供依據(jù)。 1 材料與方法 樣品來(lái)源 新鮮的 荷斯坦成年牛 牛糞便，取自青島某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng) 。 主要試劑 MYP、 LB 培養(yǎng)基、 西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂、 細(xì)菌微量生化鑒定管、 三糖 鐵瓊脂 、革蘭氏染色試劑盒均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片 購(gòu)自 杭州天和微生物 試劑有限公司。 %沙黃、 5%孔雀綠溶液 自配 。 4 儀器和設(shè)備 SWCJ2F 型雙人雙面 凈化工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備有限公司 LED2） 、電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東龍口市先科儀器公司 YY002790）、 XSP2C 生物顯微鏡。 方法 菌株的分離純化 取菌液接種于 MYP 培養(yǎng)基平板上，置于 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 18 h；挑取疑似枯草芽孢桿菌菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，將分離純化后得到的菌株命名為 “ 菌 K” 。 染色鏡檢 染色 采用革蘭氏染色法，見(jiàn)文獻(xiàn) [13]。 芽孢染色 采用 孔雀綠沙黃染色法 ，見(jiàn)文獻(xiàn) [13]。 生化試驗(yàn) 按照常規(guī)試驗(yàn)方法對(duì)菌 K 進(jìn)行 糖苷醇發(fā)酵試驗(yàn) 、 甲基紅（ MR）試驗(yàn) 、 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（ VP 試驗(yàn)） 、 淀粉水解試驗(yàn) 、 吲哚試驗(yàn) 、 產(chǎn)類淀粉化合物測(cè)定試驗(yàn) 、 檸檬酸鹽試驗(yàn) 、 TSI 試驗(yàn) 、 過(guò)氧化氫酶（觸酶）試驗(yàn) 、 KOH 試驗(yàn) 、 脲酶試驗(yàn) 、明膠液化等試驗(yàn)。 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增和序列分析 將菌 K 接種于 5 mL LB 肉湯中搖菌 10 h，取 4mL 菌液 10000r/min 離心 2min，參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法提取 DNA。 在參考了國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)后 [19]，由華大生物工程有限公司合成了一對(duì)芽孢桿菌屬特異性引物： Primer 1： 539。AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG339。， Primer 2：539。AAGGAGGTGATCCAGCC GCA339。，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 1436 bp。 PCR 反應(yīng)體系： 總體系 25μL ， DNA 模板 2μL，上下游引物各加 1μL， 10 buffer ， ， Taq 酶 ， 。 PCR 反應(yīng)條件為： 94℃ 預(yù)變性2min， 95℃ 變性 45s ， 58℃ 退火 50s， 72℃ 延伸 1min， 72℃ ， 10min，共 32 個(gè)循環(huán)， 4℃ 保存。 PCR 產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用 BLAST軟件和 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的國(guó)內(nèi)外相關(guān)芽孢桿菌 16S rDNA 的序列對(duì)比，用 Clustal 5 X Method 進(jìn)行同源性比較。 藥敏試驗(yàn) 按照擴(kuò)散法在 MYP 培養(yǎng)基上進(jìn)行 藥敏試驗(yàn) ，見(jiàn)文獻(xiàn) [13] 。 安全性試驗(yàn) 選取體重為 30~40 g 的小白鼠 10 只，每組 5 只。取菌液濃度約為 1011cfu/mL的 LB 肉湯，對(duì)空腹 8 h 的試驗(yàn)小鼠每天一次經(jīng)口灌胃 mL，同時(shí)設(shè)空白營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)照組。每天觀察和記錄， 14 d 后結(jié)束試驗(yàn)，剖檢觀察內(nèi)臟及組織器官變化。 2 結(jié)果 形態(tài)學(xué)觀察 觀察 MYP 培養(yǎng)基， 為干燥型菌落， 灰白 色，無(wú)光澤，表面粗糙。革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體呈長(zhǎng)桿狀，芽孢中生，橢圓形，染色為 綠色，菌體呈紅色。 生化試驗(yàn)結(jié)果 菌 K 的生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 21。 表 21 菌 K 生化試驗(yàn)結(jié)果 菌 K 菌 K 菌 K 葡萄糖 + 山梨醇 + 明膠液化試驗(yàn) + 蔗糖 + MR 試驗(yàn) + 觸媒試驗(yàn) + 乳糖 + VP 試驗(yàn) KOH 試驗(yàn) 圖 21 菌 K 菌落 形態(tài) （ 1000）。 圖 22 革
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