【正文】 醇丙酮 酸羧化酶CO2固定反應(yīng) (丙酮酸羧化支路 ) GA生物合成的理想途徑（ 1） GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件（內(nèi)在因素 ）α 酮戊二酸脫氫酶的活性微弱或缺失TCA環(huán)阻斷， α 酮戊二酸積累琥珀酸輔酶 A TCA環(huán)正常 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的 NADPH的氧化能力欠缺或喪失積累 NADPH，抑制 α—KGA 的脫羧氧化 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)必須有 乙醛酸循環(huán)（ DCA）的關(guān)鍵酶 —— 異檸檬酸裂解酶通過該酶酶活性調(diào)節(jié)實現(xiàn) DCA循環(huán)的封閉， GA 發(fā)酵積累 菌體有強烈的 L— 谷氨酸脫氫酶活性α—KGA + NH 4+ +NADPH == GA + NADP提供 NADPH,用于還原 α 酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián) 3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸乙酰輔酶 A+乙酰輔酶 A + 乙酰輔酶 A檸檬酸則有：3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+4CO2產(chǎn)率： 147 /（ 180*3/2） ==% CO2 谷氨酸 在前述 GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上，體系不存在 CO2固定反應(yīng)，則有：體系存在 CO2的固定反應(yīng)結(jié)論通過 DCA環(huán)提供 C4二羧酸時谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率僅為 % 在谷氨酸發(fā)酵中， DCA環(huán)可以作為 TCA循環(huán)有缺陷時 C4二羧酸的補充 .在前述 GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（封閉乙醛酸循環(huán)）存在 CO2固定反應(yīng)，則有：Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸CO2則有：C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+CO2（來自何方）產(chǎn)率： 147 / 180 == %乙酰輔酶 A + C4二羧酸 CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）蘋果酸（蘋果酸激酶）檸檬酸（ DCA循環(huán)封閉）谷氨酸四碳二羧酸的來源Δ 在生產(chǎn)菌中檢出CO2固定反應(yīng)酶活性 磷酸烯醇丙酮酸 (PEF)羧化酶和蘋果酸酶 谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到 %C6H12O6+NH3+ ──C5H9O4N+CO2+3H2O需要 Mn+做催化劑，所以，在 GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充 Mn+實際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的 C4二羧酸完全來自于 CO2固定反應(yīng)，體系也不可能完全不存在 CO2固定反應(yīng)，因此， GA 發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應(yīng)在： %——% 。目前，國內(nèi)的 GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在 50%以內(nèi)： 提高 GA的潛力是很大的，具體表現(xiàn)在： （ 1）強化 CO2固定反應(yīng)，具體措施： Mn+ ，生物素？ （ 2）控制溶氧濃度是非常重要的 低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化 …… 高的溶氧濃度，則 NADPH 有被氧化的可能， ……氨的導(dǎo)入合成谷氨酸的反應(yīng)有 3種：α酮戊二酸 + 天冬氨酸或丙氨酸 谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶 AT 谷氨酸 α酮戊二酸+α 酮戊二酸 + 谷氨酰胺 NADPH+ 2谷氨酸 NADP+谷氨酸合成酶 GSα酮戊二酸 NH4+ NADPH 谷氨酸 H2O NADP+谷氨酸脫氫酶 GHD+ + +（ 2）影響谷氨酸合成的外在因素a、生物素對糖代謝的影響生物素參與糖代謝作用： 增加糖代謝的速度 (對 TCA有促進(jìn)作用）乳酸積累碳源利用率降低，發(fā)酵液的 pH值下降。而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變 丙酮酸積累A、生物素對 GA發(fā)酵的影響主要影響糖降解速度，不影響 EMP與 HMP途徑的比率。生物素充足的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，引起乳酸的溢出。研究表明，異檸檬酸裂解酶活性 為醋酸誘導(dǎo)受琥珀酸的阻遏，抑制當(dāng) VH缺乏時： （ 1）丙酮酸的有氧氧化就會減弱？則：乙酰輔酶 A的生成量就會少，醋酸濃度降低，它的誘導(dǎo)作用降低；通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性（ 2） VH對 TCA循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強；乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸 →α 酮戊二酸 → 谷氨酸的方向高效率地移動兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失， DCA循環(huán)得到封閉。b、控制 VH的濃度，以實現(xiàn)對于乙醛酸循環(huán)的封閉c、生物素對氮代謝的影響VH豐富時，出現(xiàn) “只長菌，不產(chǎn)酸 ”的現(xiàn)象 GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定的量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。結(jié)論氨的導(dǎo)入時 生物素缺乏， NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時， NH4+不影響糖代謝速度?關(guān)于氮代謝的調(diào)節(jié)： 控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，使合成的谷氨酸不能轉(zhuǎn)化成其他氨基酸或參與蛋白質(zhì)合成。?在生物素亞適量的情況下，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應(yīng)停滯，在銨離子適量存在下，生成積累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通過轉(zhuǎn)氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白質(zhì)。?在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增強，琥珀酸氧化能力增強，丙酮酸氧化力加強，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酰乙酸、蘋果酸脫羧反應(yīng)增強，蛋白質(zhì)合成增強，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成的其他氨基酸量增加。 d、 VH對菌體細(xì)胞膜通透性的影響通常谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是 VH，而 VH又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過控制 VH的濃度（ 干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）來實現(xiàn)的來實現(xiàn)對菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié) 。葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰輔酶 A 乙酰輔酶Ａ 乙酰輔酶 A羧化酶（ 輔酶是 VH ） CO2 丙二酰輔酶 A 丙二酰輔酶 A C4 C6 CO2 培養(yǎng)基中生物素限量時，胞內(nèi) AA92%胞外培養(yǎng)基中生物素豐富 時 ，胞內(nèi) AA12%胞外 CO2 ? Glu生產(chǎn)菌大多是生物素缺陷型，發(fā)酵時控制生物素亞適 量，使細(xì)胞變形拉長，改變了細(xì)胞膜的通透性引起代謝失 調(diào)使 Glu得以積累。? 生物素貧乏時，細(xì)胞內(nèi)的 Glu含量少而且容易析出，而培 養(yǎng)基中積累大量的 Glu；生物素豐富時，培養(yǎng)基中幾乎不 積累 Glu，而細(xì)胞內(nèi)卻含有大量的 Glu，且不易被析出。 這說明生物素對細(xì)胞膜通透性有重要影響。 谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生特異性變化，使細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變成有利于谷氨酸向膜外滲透的形態(tài)，使終產(chǎn)物不斷排出細(xì)胞外，胞內(nèi)谷氨酸不能積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，胞內(nèi)谷氨酸源源不斷被優(yōu)先合成，分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中積累。B、供氧濃度 過量： NADPH的再氧化能力會加強，使 αKGA的還原氨基化受到影響，不利于 GA 的生成。供氧不足： 積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的 pH值下降，不利于 GA的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。C、 NH4+濃度 （ 1）影響到發(fā)酵液的 pH值（ 2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)： 過低，不利于 αKGA的還原氨基化；過高，產(chǎn)生谷氨酰胺。 NH4+的供給方式： （ 1）液氨 （ 2）流加尿素D、磷酸鹽 過量：（ 1）促進(jìn) EMP途徑，打破 EMP與 TCA之 間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 …… （ 2）產(chǎn)生并積累 Val， Glucose 丙酮酸 丙酮酸 + 活性乙醛 α乙酰乳酸 Val Val（ 1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使 GA的生物合成受到阻止（ 2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率（ 3） 發(fā) 酵液中的 Val存在， 嚴(yán) 重的影響 GA 的 結(jié) 晶、提出 n 研究證明：? 谷氨酸生產(chǎn)菌種存在 EMP途徑的全部酶和 HMP途徑有關(guān) 的酶? TCA循環(huán)中的檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸能定量地生 成谷氨酸，其相應(yīng)的酶與谷氨酸合成有關(guān)? 以醋酸和乙醇為原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時， DCA循環(huán)是 C4 二羧酸的唯一補充來源；但是以葡萄糖為原料時，在谷 氨酸生成期此循環(huán)應(yīng)關(guān)閉? 谷氨酸菌存在 CO2固定生成草酰乙酸的 PEP羧化酶和蘋果 酸酶，與谷氨酸得率正相關(guān)第五節(jié) 谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制一、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)① 谷氨酸脫氫酶② ?酮戊二酸脫氫酶③ 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶④ 檸檬酸合成酶⑴ 優(yōu)先合成167。 在微生物的代謝中， Glu比 Asp優(yōu)先合成； 合成過量時則抑制谷氨酸脫氫酶，使代謝轉(zhuǎn)向合成 Asp； Asp過量時反饋抑制 PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。 ⑵ 谷氨酸脫氫酶 (GDH)的調(diào)節(jié)谷 aa脫氫酶 谷 aa對其反饋抑制和反饋阻遏⑶ 檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)檸檬酸合成酶 TCA的關(guān)鍵酶，受能荷調(diào)節(jié)，谷 aa反饋阻遏，烏頭酸反饋抑制所以，正常代謝不積累 Glu ⑷ 異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié) 細(xì)胞內(nèi) α酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡。當(dāng) α酮戊二酸過量時 ,將對異檸檬酸脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用 ， 停止合成 α酮戊二酸。異檸檬酸脫氫酶 α酮戊二酸反饋抑制⑸ α酮戊二酸脫氫酶 :谷氨酸產(chǎn)生菌中先天性的喪失或微弱。⑹ 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEP受天冬 aa反饋抑制，受谷 aa和天冬 aa反饋阻遏w 喪失或有微弱的 ?酮戊二酸脫氫酶活力，使 ?酮戊二酸不能繼續(xù)氧化；w CO2固定能力強，使四碳二羧酸全部由 CO2固定反應(yīng)提供，而不走乙醛酸循環(huán)；w 谷氨酸脫氫酶的活力很強，并喪失谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋抑制和反饋阻遏，同時， NADPH2再氧化能力弱，這會使 ?酮戊二酸到琥珀酸的過程受阻；w 有過量的 NH4+存在， ?酮戊二酸經(jīng)氧化還原共軛氨基化反應(yīng)而生成谷氨酸卻不形成蛋白質(zhì)，從而分泌泄漏于菌體外；w 同時，谷氨酸生產(chǎn)菌應(yīng)不利用體外的谷氨酸，使谷氨酸成為最終產(chǎn)物。w 生產(chǎn)菌株還應(yīng)該具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特點 。二 . 谷氨酸高產(chǎn)菌模型特征三、谷氨酸生產(chǎn)的代謝調(diào)控 ?。ㄒ唬⒐劝彼嵘a(chǎn)菌的具體育種思路 （谷氨酸代謝控制發(fā)酵的基本方法和實現(xiàn)的途徑） ⑴ 選育減弱 α酮戊二酸進(jìn)一步氧化能力的突變株 減弱α酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的活性，可以使代謝流向谷氨酸，從而使谷氨酸得到積累。 ⑵ 選育減弱 HMP途徑后段酶活性的突變株 從葡萄糖到丙酮酸的反應(yīng)由 EMP途徑和 HMP途徑組成。但通過 HMP也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、輔酶 Q、維生素 K、葉酸等物質(zhì)。消耗了葡萄糖，使谷氨酸的產(chǎn)率降低。如削弱或切斷這些物質(zhì)的合成途徑，就會使谷氨酸的產(chǎn)率增加?？赏ㄟ^選育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促進(jìn)生長的突變株以及抗嘌呤、嘧啶類似物或核苷酸類抗生素，如德夸菌素、狹霉素 C抗性突變株來實現(xiàn)。⑶ 選育不分解利用谷氨酸的突變株 （不分解） 積累谷氨酸，必須使菌種不能分解利用谷氨酸，可通過選育以谷氨酸為唯一碳源，菌體不長或生長微弱的突變株來實現(xiàn)。⑷ 選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 四碳二羧酸是由 CO2固定反應(yīng)和乙醛酸循環(huán)所提供的。減弱乙醛酸循環(huán)， CO2固定反應(yīng)所占的比例就會增大，谷氨酸的產(chǎn)率就高?？赏ㄟ^選育琥珀酸敏感型突變株、不分解利用乙酸突變株、異檸檬酸裂解酶活力降低菌株實現(xiàn)。⑸ 阻止谷氨酸進(jìn)一步代謝 （不代謝） 細(xì)胞還可以谷氨酸為前體繼續(xù)向下合成谷氨酰胺等，必然導(dǎo)致谷氨酸的積累量減少。要避免谷氨酸被菌體利用，還需要切斷谷氨酸向下的代謝途徑。 ⑴ 選育耐高滲透壓突變株 菌種高產(chǎn)谷氨酸 ,應(yīng) 具備在高糖、高谷氨酸的培養(yǎng)基中能正常生長、代謝的能力，即在高滲培養(yǎng)基中菌體的生長和谷氨酸的合成不受影響或影響很小?？赏ㄟ^選育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖 +高谷氨酸突變株來實現(xiàn)。 ⑵ 選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 谷氨酸合成達(dá)到一定量時，谷氨酸會反饋抑制和阻遏谷氨酸脫氫酶，使谷氨酸的合成停止，使代謝轉(zhuǎn)向天冬氨酸的合成。若解除了谷氨酸對谷氨酸脫氫酶的反饋調(diào)節(jié)，菌體就會不斷的合成谷氨酸?？赏ㄟ^選育酮基丙二酸抗性、谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性（如谷氨酸氧肟酸鹽）、谷氨酰胺抗性突變株來實現(xiàn)。 ⑴ 選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到 α酮戊二酸代謝的突變株 這可通過選育檸檬酸合成酶活力強突變株及抗氟乙酸、氟化鈉、重氮絲氨酸、檸檬酸抗性等突變株來實現(xiàn)。 ⑵ 選育強化 CO2固定反應(yīng)的突變株 這可通過選育以琥珀酸或蘋果酸為