【正文】 ? 薄層層析的方法 ： ? 點樣，展開，顯色，定性與定量分析 ? 高效液相層析法 ? 高效液相層析法 (high performance liquid chromatography, HPLC)，又稱高壓液相色譜法 、高速液相色譜法、現(xiàn)代液相色譜法等，是在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分析技術(shù)。特別適用于高沸點、不能氣化或熱穩(wěn)定性差的有機物分離分析，在生物化學與分子生物學中的應(yīng)用日益廣泛。 ? 高效液相層析法有哪些？ ? 1） .吸附層析 ? 2） .分配層析 ? 3） .離子交換層析 ? 4） .凝膠滲透層析 ? HPLC的特點 ? 具有高壓、高速、高效、高靈敏度等特點，因此廣泛應(yīng)用于氨基酸、蛋白質(zhì)、甾族化合物、糖類、有機酸、生物堿、藥物、農(nóng)藥、抗菌素、維生素、高聚物以及各種無機鹽類的分離與分析。 ?四 、 檢驗記錄及檢驗結(jié)果的報告 ? （一）檢驗記錄 ? 毒物檢疫人員對每次收到的檢材按規(guī)定要求多出詳細的記錄，與送檢人員核對送檢單上所訴采集材料的時間、名稱、重量、包裹情況，并注明驗檢日期。對檢驗單上未詳述的內(nèi)容，特別是發(fā)病前后的情況，如臨床癥狀、尸體剖檢變化、現(xiàn)場調(diào)查的初步印象、治療效果及要求檢驗的項目等要與送檢人員座談并把詳細情況記錄下來。 ? （二）檢驗結(jié)果的判定和報告 ? 毒物檢驗及結(jié)果通知單 編號 檢驗編號 接收時間 年 月 日 送檢單位 送檢人 送檢材料 采樣時間 采樣重量 包裝 發(fā)病情況 送檢要求 檢驗結(jié)果 通知時間 編號 ? 檢驗結(jié)果與臨床記錄完全符合。 ? 檢驗的各項結(jié)果均為陽性（如可疑飼料、胃內(nèi)容物、嘔吐物等）與中毒病畜的臨癥、尸變完全一致，可做出某種毒物中毒的結(jié)論。 ? 檢驗結(jié)果與臨床記錄部分符合。 ? 檢驗結(jié)果陽性，現(xiàn)場也發(fā)現(xiàn)致病毒物，但與尸變不一致，首先考慮送檢材料是否是該中毒動物的檢驗材料。 ? 檢驗結(jié)果與臨床記錄完全相反。 ? 檢驗結(jié)果陰性，但臨癥和尸變與該種毒物引起的中毒表現(xiàn)一致，要考慮送檢的檢材采集的部位是否合適。 檢驗結(jié)果的判定 第二節(jié)水溶性毒物的檢驗 ? （一）水浸法 ? 將檢材研碎，用蒸餾水浸泡 1h并稍加熱，攪拌，然后進行過濾或離心分離，濾液或離心分離液供檢驗用。如顏色過深，可加活性炭脫色。 ? （二）透析法 ? [原理 ] ? 無機化合物或低分子有機化合物的離子或小的分子，在溶液 中可以通過半透膜；而一些分子結(jié)構(gòu)大的化合物，如脂肪、蛋白質(zhì)等卻不能通過半透膜，從而得以分離。 ?一、水溶性毒物的提取 ? [操作 ] ? 半透膜的制作 取火棉膠數(shù)毫升，傾于潔凈干燥的小燒杯（或其他理想的容器）中迅速轉(zhuǎn)動燒杯，使火棉膠均勻地分布在燒杯內(nèi)壁上，形成一層薄膜，將多余的火棉膠倒回原瓶中，待膜稍干，輕輕用刀尖將邊緣剝離，向薄膜和燒杯之間輕輕吹氣或注水，即可完全取下，將其放置在一個裝有水的燒杯中，待用。 ? 透析 將檢材研碎或剪細后，裝入半透膜內(nèi)，將半透膜口捆扎在一根玻璃管上，然后將其放于適當大小的燒杯內(nèi)，從玻璃管向透析膜內(nèi)加入蒸餾水，使液面淹沒檢材，再往燒杯內(nèi)加蒸餾水至與檢材液面同一水平，透析1h，膜外的透析液供檢驗用。 ? 為了增加透析速度及提高透析效率，可將燒杯適當加熱（不超過 50℃ ）。如要透析完全，則需時間長些（最好在冰箱內(nèi)進行，防止檢材腐?。⒏鼡Q膜外的蒸餾水數(shù)次，然后合并透析液，在水浴濃縮后供檢驗用。 亞硝酸鹽中毒 是由于采食 富含 亞硝酸鹽或硝酸鹽 的飼料，引起 高鐵（ Fe3+ ）血紅蛋白 血癥 ，導致組織缺氧的一種急性、亞急性中毒。 ?臨床上以 黏膜發(fā)紺、血液褐變、呼吸困難、胃腸道炎癥為特征。主要發(fā)生 豬 ，牛、羊、馬也有發(fā)生。 ?二、亞硝酸鹽的檢驗 ?（一）檢材及處理 ? 亞硝酸鹽為水溶性毒物，故可采取剩余飼料、嘔吐物、胃內(nèi)容物及血液等作檢材，檢材用水浸法或透析法處理，取濾液或透析液作檢液。 ? ①胃內(nèi)容物、嘔吐物、剩余飼料中亞硝酸鹽的提取：取上述檢材 10到 20克加適量蒸餾水調(diào)成糊狀，過濾，濾液若有顏色，可用活性炭脫色。 ? ②血清：靜脈采血后離心沉淀，分離血清備用。 ? ? 樣品采取時應(yīng)注意的事項： ? ①應(yīng)當無化學污染或殘渣； ? ②樣品不能用水沖洗，可能除去殘毒；水可污染樣品； ? ③樣品保存條件：組織樣品，應(yīng)在冰凍條件下送往實驗室；血清和血液樣品，不應(yīng)冰凍，但可低溫保存； ? ④樣品內(nèi)不要加防腐劑或福爾馬林，除非有特殊原因應(yīng)加以說明；⑤樣品應(yīng)注明畜主姓名、畜別或號數(shù)、死亡日期、取料日期、送檢要求及送檢單位等。 ?（二）定性檢驗 ? 高鐵血紅蛋白的鑒定 ? （ 1） .取血液少許與小試管內(nèi) ,用力振搖 ,血液不變色 ,可認為是高鐵血紅蛋白 .通常血液會與空氣中的氧結(jié)合呈鮮紅色。 ? （ 2） .取血液少許與小試管內(nèi) ,滴入數(shù)滴 1%KCN溶液 ,若有高鐵血紅蛋白 ,血液立即由棕褐色變?yōu)轷r紅色。 ? 格利斯（ Griess）反應(yīng)（ 靈敏度 1： 5000000） ? [原理 ] 亞硝酸鹽在酸性溶液中與氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，再與甲 萘胺作用生成洋紅色的偶氮色素。 ? [試劑 ] 格利斯試劑：取甲 — 萘胺 1g，對氨基苯磺酸 10g，酒石酸 89g，置于乳缽中，研細，混勻，保存于密封的棕色瓶中，備用。 ? [操作 ] 取檢液（或血清） 1— 2ml 放入小試管中，加入格利斯試劑 — ，振蕩試管，觀察顏色變化，如有亞硝酸鹽存在，立即呈現(xiàn) 紅色 ，顏色的深淺視含量而定，粗略比例見下表。 亞硝酸鹽概略定量表 溶 液 的 顏 色 NO的含量（ mg/L） 剛剛 呈現(xiàn)玫瑰色 淡玫瑰色 玫瑰色 鮮艷玫瑰色 深紅色 小于 大于 本反應(yīng)亦可在白瓷反應(yīng)板上進行，其操作方法是取格利斯試劑干粉少許于白瓷反應(yīng)板凹窩中，加檢液 3— 5滴，用小玻璃棒攪勻，如有亞硝酸鹽存在，即顯紫紅色，陰性不顯色。 ? 聯(lián)苯胺冰醋酸反應(yīng) （靈敏度 1： 400000） ? [原理 ] 亞硝酸鹽在酸性溶液中，將聯(lián)苯胺重氮化生成一種醌式化合物，而呈現(xiàn)棕紅色或黃紅色。 ? [試劑 ] 聯(lián)苯胺冰醋酸溶液：取聯(lián)苯胺 10ml冰醋酸中，加蒸餾水稀釋至 100ml。過濾，濾液盛于棕色瓶中備用。 ? [操作 ] 取檢液 1— 2滴，置白瓷反應(yīng)板上，加 1— 2滴聯(lián)苯胺冰醋酸溶液，如有亞硝酸鹽存在，即出現(xiàn) 紅棕色 。亞硝酸鹽含量大時，試劑需多加數(shù)滴，才能出現(xiàn)顏色。 儀器： YNCLVI型智能化農(nóng)藥殘留快速檢測儀 (農(nóng)藥殘毒、重金屬、亞硝酸鹽、甲醛四合一綜合測速儀 ) 第三節(jié) 揮發(fā)性毒物的檢驗 ?一、揮發(fā)性毒物的分離提取 方法 ? 水蒸餾法 ? 揮發(fā)性毒物多具有較高的蒸汽壓，當遇酸性溶液同時加熱時，可在較原沸點為低溫度下隨水蒸氣蒸餾出來，根據(jù)這一特性達到分離目的。 ?離心法 ? 血液及尿液檢樣不適宜用水蒸氣蒸餾法分離提取揮發(fā)性毒物，可采取離心分離提取，取血液及尿液 10ml與50ml離心管中，加冰乙酸、碳酸鉀充分混合，離心取上清液供檢。 ?微量擴散法 ? 適用于各種揮發(fā)性毒物的分離提取，特別是被檢樣量很小時，不宜進行水蒸氣蒸餾，用此方法分離極為方便。主要儀器為康威（ conway）擴散池 ?二、氫氰酸和氰化物的檢驗 ? 氫氰酸中毒是家畜采食富含 氰甙類 植物或 被 氰化物 污染 的飼料、飲水后、體內(nèi)生成 氫氰酸 、導致 以 呼吸困難、震顫、驚厥 等 組織性缺氧 為特征的一種急劇性中毒病。 ? 一般多見于 牛和羊 ，馬、豬、犬偶爾發(fā)生。 ? 富含氰甙的植物 ： ? 高粱屬植物 ? 亞麻，主要是亞麻葉、亞麻籽及亞麻籽餅； ? 木薯 ? 苦杏仁、銀杏、枇杷仁 ? 各種豆類 ? 牧草 ? 誤食或吸入氰化物農(nóng)藥 病因 ? （一）檢材 ? 供檢驗氫氰酸和氰化物最適宜的檢材是中毒動物吃剩的飼料，病畜的嘔吐物，其次是肺、腦、肝和血液。本實驗采取 水蒸氣蒸餾法提取 口粘膜、食道和胃及胃內(nèi)容物。 ? 氫氰酸為無色易揮發(fā)的液體，有苦杏仁味，沸點℃ ，在室溫中即可揮發(fā)，特別是在酸性環(huán)境中很快分解，故應(yīng)及時檢驗。嚴重腐敗的檢材，很難檢出氫氰酸或氰化物。 ? （二）定性檢驗 ? 快速普魯士藍法 （靈敏度 — 10μg） ? [原理 ] 酸化的檢樣受熱后，氰化物變成氫氰酸逸出，在堿性條件下與硫酸亞鐵作用，生成亞鐵氰絡(luò)鹽，用酸酸化后，與高鐵離子反應(yīng)，生成普魯士藍： ? [試劑 ] ? （ 1） 10%酒石酸溶液。 ? （ 2） 10%硫酸亞鐵溶液（用時現(xiàn)配）。 ? （ 3） 10%氫氧化納溶液。 ? （ 4） 10%鹽酸。 ? [操作 ] . ? 取檢樣 510g置于三角燒瓶中，加蒸餾水，使成粥狀，加 10%酒石酸酸化，立即在瓶口上蓋一張濾紙，并迅速向濾紙的中央加 10%硫酸亞鐵 12滴，稍干，再加 10%氫氧化鈉 12滴，然后緩緩加熱，當微沸有蒸氣產(chǎn)生時，把濾紙取下（瓶口再蓋一張濾紙，重復操作），向濾紙上滴加 10%鹽酸或?qū)V紙浸于 10%鹽酸溶液中，如有氰化物，濾紙立即顯 藍色 ，若含量低，可顯 藍綠色。 ? [說明 ] ? ⑴ 本方法不需水蒸餾，可用檢樣直接檢驗，所以具有操作簡便，快速等優(yōu)點。 ? ⑵ 若檢樣是血液時，可加 20%三氯乙酸酸化并使蛋白質(zhì)凝固。 ? ⑶ 也可用蒸餾液進行此反應(yīng)，其方法是取堿性接收液2ml于試管中，加 10%硫酸亞鐵溶液 23滴，微熱，加10%鹽酸酸化，如有氰化物存在，即產(chǎn)生藍色或藍綠色，含量高時，可產(chǎn)生藍色沉淀。 ? 苦味酸試紙法 （靈敏度 15ug） ? [原理 ] 氰化物在弱酸性條件下受熱產(chǎn)生氫氰酸，遇碳酸鈉生成氰化鈉，再遇苦味酸即生成異紫酸鈉，呈玫瑰色。 ? [試劑 ] ? （ 1） 10%酒石酸溶液。 ? （ 2） 10%苦味酸溶液。 ? （ 3）飽和碳酸鈉溶液。 ? [操作 ] 取檢樣 5:10g置于三角瓶中，加蒸餾水使呈粥狀，加 10%酒石酸酸化，立即在瓶口上懸一條事先準備好的堿性苦味酸試紙條，蓋好膠塞，在小火上緩緩加熱，如有氰化物存在則試紙條變?yōu)?玫瑰紅色 。 ? 堿性苦味酸試紙制法 : 可取定性濾紙一條在 10%苦味酸溶液中浸濕，并用濾紙吸去多余溶液，再滴加飽和碳酸鈉溶液，陰干即可應(yīng)用。 ? [說明 ] ? （ 1） 本反應(yīng)不是氰化物的專一反應(yīng)，酮、醛、硫化氫等還原物質(zhì)也可呈陽性反應(yīng)，因此，需做空白對照試驗，或用其他試驗確證。 ? （ 2） 此方法可與快速普魯士藍法同時進行，即將堿性苦味酸試紙條懸于瓶內(nèi)，瓶口蓋上濾紙做快速普魯士藍反應(yīng)。 ? 第四節(jié) 金屬毒物及微量元素的檢驗 ? 金屬及化合物種類繁多，常見的有汞、砷、鉛、錫、鉈、鋇、鎘幾種元素及其化合物。 ? 金屬及其化合物在體內(nèi)的毒理作用主要通過它與含有硫、氮、氧基團的酶結(jié)合，使蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶的活性被抑制甚至消失而影響細胞的新陳代謝。當它與細胞膜上的配體結(jié)合時可引起膜的主動或被動運輸改變。 ? 金屬及其化合物發(fā)生急性中毒的很少，大部分為污染或工作環(huán)境導致的慢性中毒。 ? 這里著重講述 汞、砷、鉛 三種金屬的毒性， 錫、鉈、鎘等可自習。 ?一 、汞化合物的檢驗 (砷化物的檢驗 ) ?汞含 金屬汞、無機汞和有機汞 三種形式，其中有機汞的毒性較大。畜禽攝取了被汞及其化合物污染的飼料和飲水能引起中毒，在臨床上以呈現(xiàn) 胃腸炎、腎炎和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征。各種家畜都能發(fā)生中毒，但以牛、羊?qū)顬槊舾?。汞中毒不僅能造成畜禽大批死亡，而且受其污染的動物性食品被人食用后也能危害人的健康 。 58 汞 ?汞 (mercury， Hg)，又稱水銀，是唯一在常溫下呈液態(tài)并易流動的金屬 。 ?汞很易蒸發(fā)到空氣中引起危害，因為 : ?（ 1）在 0℃ 時已蒸發(fā)，氣溫愈高，蒸發(fā)愈快