【正文】 懸液呈輕度乳濁即可。3．同法取枯草桿菌培養(yǎng)物少許，于第二格內(nèi)混勻。4．輕輕搖動玻片，經(jīng)12分鐘后肉眼觀察，出現(xiàn)乳白色凝集塊者，即為陽性反應；仍為平等的乳濁液者，即為陰性反應。如結(jié)果不夠清晰，可將玻片放于低倍顯微鏡下觀察。（二） 試管凝集反應 為一種定量試驗，用已知抗原檢查血清中有無特異抗體，并測定其相對含量。 材料：1．診斷血清1：10稀釋傷寒桿菌“H”血清，1：10稀釋傷寒桿菌“O”血清。2．菌液：傷寒桿菌“H”菌液，傷寒桿菌“O” 菌液。3．生理鹽水，小試管，吸管。方法：1．取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上，每排7只依次用蠟筆注明號碼。2．在第1排1管中加入1：，于管內(nèi)連續(xù)吹吸3次，使血清與鹽水充分混合。依次類推，稀釋到第6管。此時，自第1管至第6管的血清稀釋倍數(shù)為1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第7管不加血清作為對照。3．同法用吸管吸取1：10稀釋傷寒桿菌O血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀釋。4．用移液管吸取傷寒桿菌H菌液，（由鹽水對照管開始，依次由后向前加入）此時血清稀釋倍數(shù)又增加了一倍。5．。6．將各管振蕩混勻，放37℃水浴箱中2—4小時或37℃孵育箱中過夜次日取出觀察結(jié)果。觀察結(jié)果：1．觀察切勿搖動試管，以免凝集塊分散。2．先看對照管，此管應無凝集現(xiàn)象，管內(nèi)液體仍成混濁狀態(tài)。但如放置時間較長，細菌堆于管底成小圓點狀，為陰性反應。3．試驗管應自第1管看起，如有凝集時則于管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物，上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用“+”號表示如下：“++++”凝集很強，管內(nèi)液體完全澄清，凝集塊完全沉于管底；“+++”凝集強，管內(nèi)液體不完全澄清稍有輕度混濁，凝集塊沉于管?底；“++”凝集中等強度，液體半澄清，凝集塊沉于管底；“+”凝集弱，管內(nèi)液體混濁，少量凝集塊沉于管底；“－”不凝集，管內(nèi)液體和對照管同樣混濁，無凝集塊。4．輕輕振蕩各管，觀察凝集塊的狀態(tài)，對照管的細菌在振蕩時呈煙霧狀上升，隨即消散，細菌分散仍呈混濁狀態(tài)?！癏”菌液的凝集塊疏松呈棉狀，大片沉于管底輕搖即升起，并極易破碎。“O”菌液凝集呈緊密顆粒狀，沉于管底堅實致密，輕輕振搖不易升起，凝集顆粒較小不易搖碎。5．記錄觀察的結(jié)果并制定凝集效價。通常以能產(chǎn)生明顯凝集（++）的血清大稀釋倍數(shù)作為該血清的凝集效價。如血清的最低稀釋度（即第1管1：40）仍無凝集應報告為低于1：40。如血清的最高稀釋度（即第6管1：1280）仍顯完全凝集現(xiàn)象。，應報該血清效價高于1：1280。二．間接凝集反應將可溶性抗原吸附于一種與免疫無關的顆粒載體上，然后與相應的抗體結(jié)合，也可出現(xiàn)顆粒載體的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應。間接凝集反應比直接凝集反應敏感性為高，可用于微量抗體或抗原的檢查。（一） 間接血球凝集試驗間接血球凝集試驗是根據(jù)紅血球表面的吸附作用而建立起來的。將細菌可溶性抗原提出使之吸附于紅血球表面，此時紅血球即稱為“致敏紅血球”。這種致敏的紅血球具有細菌的抗原性，與相應的抗血清相遇可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。間接血凝抗原的制備可用加堿或加熱的方法使菌體中的多糖物質(zhì)浸出，去除類脂以免干擾紅血球的吸附作用。但如系蛋白質(zhì)時則用來吸附的紅血球需先用鞣酸予以處理。材料：1．抗原—傷寒桿菌O抗原2．免疫血清：傷寒桿菌O901免疫兔血清3．25%綿羊紅血球懸液，生理鹽水，試管吸管等方法：1．“O”抗原的制備：將每毫升100億的傷寒桿菌“O”菌懸液，置100℃水浴中2小時，離心沉淀吸取上清夜，分裝無菌試管，放4℃冰箱備用。2．致敏紅血球懸液制備：%綿羊紅血球懸液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分鐘取出振搖一次，共經(jīng)2小時。然后取出，用生理鹽水洗滌3次，%懸液即成。3．試驗步驟：（1）小試管9只標好號碼于試管架上。（2）。（3）。如此依次稀釋直至第8管。第9管不加血清作對照。（4）%綿羊紅血球懸液，混勻后放入37℃水浴中2小時后觀察結(jié)果。凡最高血清稀釋度的免疫血清試管中呈現(xiàn)完全血凝者，即為該血清的間接血清效價。（二） 間接凝集抑制試驗若使可溶性抗原與相應抗體先混合，充分作用后再加入有關的免疫微球，因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的被動凝集現(xiàn)象，叫間接凝集抑制試驗，臨床化驗檢查中常用的免疫妊娠試驗就是一種間接凝集抑制試驗。妊娠試驗：孕婦尿中絨毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此當往尿中加入抗絨毛膜促性腺激素抗體時，由于發(fā)生抗原抗體反應的結(jié)果，抗體被消耗，此時再往尿中加入膠乳抗原（吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳膠顆粒）。不發(fā)生反應，抗原仍呈乳狀液體，即為妊娠試驗陽性。反之，被檢尿中絨毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗體消耗，當膠乳抗原加入后，抗體便與抗原結(jié)合發(fā)生反應。出現(xiàn)均勻細小顆粒，妊娠試驗為陰性。材料：1．抗原：吸附有人類絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原2．抗體：抗人類絨毛膜促性腺激素抗體血清3．被檢材料：孕婦尿4．正常尿作對照用5．黑反應板1塊6．滴管3只方法：1．用清潔滴管在反應板上滴加一滴被檢尿。2．再往尿滴加抗血清一滴，輕輕搖動，充分混勻。3．滴加一滴膠乳抗原，緩慢搖動3—5分鐘，在較強光線下，觀察結(jié)果。出現(xiàn)均勻一致的細小顆粒為陰性反應，懷孕。注意事項：1．試驗材料用具用前使溫度接近室溫（20℃左右）2．被檢尿太混濁，需要小心過濾。3．尿中有蛋白及血液時，不宜進行此試驗。（三） 協(xié)同凝集試驗金黃色葡萄球菌細胞壁成分中的A蛋白能與人及多種哺乳動物（豬、兔、羊、鼠等）血清中IgG類抗體 的Fc段結(jié)合。IgG的Fe段與SpA結(jié)合后，兩個Fab段暴露在葡萄球體表面，仍保持其抗體活性和特異性當其與特異性抗原相遇時，也出現(xiàn)特異凝集現(xiàn)象。在以凝集反應中，金黃色葡萄球菌菌體成了IgG抗體的載體,.A. 材料：1. 抗原:可溶性傷寒桿菌O抗原2. 免疫血清：傷寒桿菌0901免疫兔血清3. 10%CoWan1株金黃色葡萄球菌（含大量蛋白A）的菌液4. %甲醛PBS，吸管、滴管、玻片等B. 方法：1．10%葡萄球菌菌懸液的制備：CoWan1株葡萄球菌接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng)1824小時，用PBS洗下菌苔，每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20分鐘。沉淀菌用PBS洗兩次后，%甲醛（用PBS配置）在室溫中固定3小時。置于80℃水浴中4分鐘以破壞菌體的自源性分解酶。再用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。2．致敏葡萄球菌： 1毫升10%℃水浴中30分鐘（中間需搖動兩次）。取出后經(jīng)每分鐘2500轉(zhuǎn)速度離心20分鐘，棄去上清液，沉淀菌用PBS洗滌2次后配成10%菌懸液。3．協(xié)同凝集試驗?取傷寒“O”可溶性抗原一滴致敏葡萄球菌懸液，一滴在載波片上混勻，觀察約2分鐘。一般在幾秒鐘內(nèi)即可發(fā)生凝集。 ?滴一滴致敏葡萄球菌懸液于玻片上，用接種環(huán)取傷寒O菌培養(yǎng)物少許置于懸液中使成均勻孔狀，觀察約2分鐘，記錄有無凝集。?用傷寒“O”桿菌培養(yǎng)物與未致敏的葡萄球菌菌液或用痢疾桿菌培養(yǎng)物與致敏的葡萄球菌菌液作玻片凝集，均為陰性反應，不出現(xiàn)凝集。三．凝集吸收腸道桿菌中的許多細菌都有部分相同的抗原結(jié)構(gòu)。因之一種細菌可與另一種細菌相應的抗血清發(fā)生交叉凝集反應。用一種過量的細菌抗原與發(fā)生交叉凝集反應的抗血清相結(jié)合。可將其共同抗體吸去，剩下抗體只能與特異性抗原起反應，這種試驗即稱凝集吸收試驗。利用凝集吸收試驗可制備單價因子血清，以進行細菌抗原結(jié)構(gòu)的分析及鑒定菌型。材料：1. 免疫血清：1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清。2. 菌液：腸炎桿菌菌液，傷寒桿菌菌液。3. 試管、吸管、毛細吸管。方法：1. 1/10稀釋傷寒桿菌免疫血清分別與腸炎桿菌與傷寒桿菌進行玻片凝集，可見傷寒免疫血清與兩種菌均有凝集，說明二菌具有共同抗原結(jié)構(gòu)，故發(fā)生交叉凝集反應。2. 將一定量的腸炎桿菌菌液加入1：10稀釋傷寒桿菌免疫血清中，放37℃水浴箱中作用2小時，取出后離心沉淀，吸取上清夜，棄去沉淀。3. 將吸收過的上清夜與稀釋腸炎桿菌菌液做玻片凝集，觀察結(jié)果。如仍有凝集時則將此上清夜再加濃腸炎桿菌菌液進行吸收，方法如上。4. 重復吸收過的上清夜分別與稀釋腸炎桿菌及傷寒桿菌菌液進行玻片凝集。如與前者無凝集而與后者有凝集，則表示傷寒桿菌免疫血清中的抗腸炎抗體已被完全吸收。實驗四 溶血反應和補體結(jié)合試驗一．溶血反應免疫血清與其相應的抗原細胞（血球、細菌及其組織細胞相遇，并在補體的參與下可出現(xiàn)溶細胞反應。依抗原、抗體的種類不同可有溶血反應、溶菌反應等。溶菌反應只在某些細菌中出現(xiàn)（如霍亂弧菌）。應用溶血反應是補體結(jié)合反應中不可少的因素。溶血反應是由于抗原（紅血球）和抗體（溶血素）進行特異性的結(jié)合，并吸著了補體，而使紅血球在補體的作用下被溶解，于是產(chǎn)生了溶血現(xiàn)象。材料：1. 抗原：2%綿羊紅血球。2. 抗體：溶血素3. 補體：取健康豚鼠血清作為補體。4. 小試管、生理鹽水、水浴箱。方法：1．取小試管3只，按下表加入各物（容量單位為毫升）試管2%紅血球溶血素（2單位）補體（2單位）生理鹽水結(jié)果12——3——2．將上述3試管放在37℃水浴箱內(nèi)15—30分鐘觀察有無凝血現(xiàn)象。二．補體結(jié)合反應當抗原與其對應的抗體結(jié)合時，所生成的抗原抗體復合物能從溶液中將補體吸著此即謂補體結(jié)合。參與補體結(jié)合反應的抗原是透明的溶液，故補體結(jié)合現(xiàn)象不能被肉眼看出來，因此必須借助溶血系統(tǒng)（溶血素及相對應的羊血球）作為指示劑，來判定媒質(zhì)中有無游離的補體，近而推定媒質(zhì)中未知抗原（或抗體）和已知抗體（或抗原）是否進行了特異性的結(jié)合。本反應具有很高的敏感性及特異性，因之常應用于傳染病的診斷，特別診斷病毒疾病和梅毒。 由于參與本反應的各種成分間有著一定量的關系，因此在作本試驗之前，必須通過一系列的預備實驗來確定各成分的使用量，故本反應的實驗方法較為復雜。本次實驗以傷寒桿菌免疫血清與其相對應的抗原補體結(jié)合試驗為例。材料：1. 抗原：傷寒的抽出液2. 抗體：傷寒桿菌的免疫血清3. 補體：豚鼠血清4. 溶血素：抗綿羊血細胞的兔血清5. 2%綿羊紅血球6. 小試管、試管架、水浴鍋。方法：（一） 預備試驗（示教說明）預備試驗包括溶血素效價的滴定，補體效價的滴定，抗原效價的滴定及被檢血清的處理。（1） 溶血素效價的滴定按照下表加入各物管號溶血素（ml）溶血素稀釋倍數(shù)1：20補體?（ml）生理鹽水?（ml）2%羊血球（ml）假定結(jié)果11：300搖勻后置37?℃水浴一小時全溶解21：500全溶解31：800全溶解41：1000全溶解51：1200全溶解61：1600全溶解71：2000全溶解81：2400全溶解91：3200全溶解101：4000111：4800121：6000對照1凡最高稀釋度的溶血素可呈現(xiàn)完全溶血者為一個單位。依上表結(jié)果第10管（即1：4000倍稀釋），所以試驗時應取1：2000倍稀釋的溶液。（2） 補體單位滴定依下表加入各試劑：管號補體(1：20)（ml）抗原(ml）生理鹽水(ml）置于37?℃水浴45分鐘溶血素(2單位）（ml）2%羊血球懸液（ml）置于37?℃水浴15分鐘結(jié)果1不溶血2稍溶血3全溶血4全溶血5全溶血6全溶血7全溶血8不溶血能引起完全溶血的最小補體量稱為準確單位，上表中第3管（），但因補體的效價可能有部分損失，故普通稍高的一管為實用單位，實際試驗時須用兩個實用單位。上表的結(jié)果為：補體標準單位：補體實用單位：補體兩個實用單位：，可依下列比例關系換算：20：=ⅹ：ⅹ= 。（3） 抗原的滴定在用已知抗原測定未知抗體時，必須先滴定抗原效價以決定本試驗時所需抗原的最適濃度（反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗體效價） 試 管號劑1234561：5稀釋血清－－－傷寒抗原2U－－－－痢疾抗原1：80－－－－－補體2U生理鹽水－－搖勻放置37℃水浴中30min溶血素2U－2％羊血球搖勻放置37℃水浴中15min說明試驗管特異性對照血清對照抗原對照溶血素對照羊血球?qū)φ杖缪鍖φ展艹释耆虿糠植蝗苎菫榭寡a體現(xiàn)象。血清嚴重污染細菌，混有淋巴液或顯著溶血時，常產(chǎn)生很強抗外體作用。又如試管、吸管不清潔，也可出現(xiàn)抗補體。若有抗補體發(fā)生，應抽血重試驗。 實驗五 T、B淋巴細胞分離試驗淋巴細胞主要分T淋巴細胞和B淋巴細胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進行某些免疫學實驗時